Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN

BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN

BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ

2. GS. TS. CHU HOÀNG MẬU

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết

quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày

trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các Tạp chí khoa

học chuyên ngành và trong Kỷ yếu Hội nghị Khoa học-Công nghệ với sự

đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thu Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu

Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, xin chân

thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào

thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh

nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án.

Xin cảm ơn sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu và các đồng nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm cùng tập thể cán

bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận án.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-Kỹ thuật Nông nghiệp và Phòng

Quản lý sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên, xin

cảm ơn lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm và lãnh đạo Đại học Thái Nguyên.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban chủ nhiệm khoa Khoa

học cơ bản, Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Y Dƣợc – Đại học Thái Nguyên.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thu Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU............................................................................................................................................................................................1

1. Đặt vấn đề....................................................................................................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................................................................................2

3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................................................................2

4. Những đóng góp mới của luận án....................................................................................................................3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.............................................................................................................................4

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................................................5

1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1.........................................................5

1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1.....................................................................5

1.1.2. Virus cúm A/H5N1................................................................................................................................................6

1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1..............................................................19

1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1.......................................................19

1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1....................22

1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN

XUẤT VACCINE THỰC VẬT................................................................................................................................27

1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tƣơng.................................................................................27

1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong chọn giống đậu tƣơng..................38

1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực

vật.............................................................................................................................................................................................................43

Chƣơng 2: VẬT LIỆ ...............................48

2.1. VẬT LIỆU.........................................................................................................................................................................48

ực vật........................................................................................................................................48

ại vector...................................................................................................48

2.1.3. Hóa chất..........................................................................................................................................................................48

2.1.4. Thiết bị..............................................................................................................................................................................48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

iv

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................................................................................49

2.2.1. Nhóm phƣơng pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen...................................50

2.2.2. Các phƣơng pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in

vitro.........................................................................................................................................................................................................56

ển gen ....................................................................................61

2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN.............................62

Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..........................................63

3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN

GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1.............................................................................................................................63

3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA........................................................63

3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1.....................................77

3.2.HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN THÔNG

QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG..............................85

3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tƣơng

ĐT12 và DT84..........................................................................................................................................................................86

3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tƣơng thông qua vi khuẩn................. 94

3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tƣơng............................99

3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG....101

3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tƣơng

chuyển gen ở thế hệ T0 .................................................................................................................................................101

3.3.2. Phân tích các dòng cây đậu tƣơng chuyển gen ở thế hệ T1 ..............................103

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................................................................107

CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.........................109

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................................................110

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

v

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

AS Acetosyrigone

A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

BAP 6-benzyladenine purin

bp Base pair

CCM Cocultivation medium

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

đtg Đồng tác giả

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli Escherichia coli

GA3 Gibberellic acid

GM Môi trƣờng nảy mầm

gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

IAA Indoleacetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

kb Kilo base

LB Luria and Bertani

MS Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

NAA α-Naphthaleneacetic acid

nptII Neomycin phosphotransferase gene

OD Optical density

PCR Polymerase Chain Reaction

PPT Phosphinothricin

RM Môi trƣờng ra rễ

SDS Sodium dodecylsulfat

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

vi

SIM Môi trƣờng tạo chồi

SEM Môi trƣờng kéo dài chồi

Taq Thermus Aquaticus

T-DNA Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

Ti- plasmid Plasmid tạo khối u

T0, T1, T2 Các thế hệ cây đậu tƣơng chuyển gen

T0 Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh từ chồi

T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1

T2 Hạt của cây chuyển gen T1 nảy mầm thành cây T2

Vir Virulence Region

v/p vòng/phút

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

YEP Yeast extract peptone

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

vii

DANH MỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 50

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 50

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ligation 52

Bảng 2.4 Thành phần hóa chất tách plasmid 52

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng LR 54

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế 55

Bảng 2.7 Thành phần môi trƣờng nuôi khuẩn 56

Bảng 2.8 Thành phần các loại môi trƣờng nuôi cấy in vitro 57

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA 66

Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1 78

Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy

mầ

86

Bảng 3.4 89

Bảng 3.5 Ảnh hƣởng củ ến khả năng kéo dài chồi 91

Bảng 3.6 Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng tạo rễ 92

Bảng 3.7 Kết quả chuyển gen gus vào nách lá mầm đậu tƣơng

thông qua vi khuẩn A. tumefacines

95

Bảng 3.8 Khả năng tái sinh thông qua nách lá mầm của giống đậu

tƣơng ĐT12 sau khi biến nạp cấu trúc gen HA1

100

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

viii

DANH MỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

Hình 1.1 Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein

của virus cúm A/H5N1

11

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc protein Hemagglutinin 15

Hình 1.3 Sơ đồ xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ 18

Hình 1.4 Khối u thực vật do A. tumefaciens 30

Hình 1.5 Cấu trúc Ti- Plasmid 32

Hình 1.6 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens 34

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 49

Hình 2.2 Sơ đồ ậu tƣơng 59

3.1

(SLHEP) (B)

64

Hình 3.2 HA (HAop) 65

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA

67

Hình 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel 68

Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector

p201-SLEHP tạo p201-SLEHP-HA/HA1

69

Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp

vào E.coli

70

Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid

tái tổ hợp p201-SLHEP-HA

71

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ix

3.8 - o vector

pPhaso-dest tạo pPhaso-dest-HA/HA1

72

3.9 Hình ả -HAop 73

3.10 Hình ảnh điện di sản phẩ

A. tumefaciens CV58

75

Hình 3.11 Sơ đồ mô tả sự tái sinh và chuyển gen HA ở cây thuốc lá 76

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩ

HA

77

Hình 3.13 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

HA1 bằng XhoI-HA1/HindIII-HA1

78

Hình 3.14 eotide và trình tự amino acid suy diễn của

đoạn gen HA1

80

Hình 3.15 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid

tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1

81

3.16 Hình ả ển gen mang cấu

trúc pPhaso-SLEHP-HA1

82

3.17. Hình ảnh điện di sản phẩ

58

84

3.18 Kết quả điện di sản phẩ

1

85

Hình 3.19 Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau 88

Hình 3.20 Cụm chồi tạo đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM 90

Hình 3.21 Cụm chồi trên môi trƣờng kéo dài SEM 91

3.22 95

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

x

(B)

3.23 Hình ảnh kết quả nhuộm X-gluc để kiểm tra

gen gus

96

Hình 3.24 Sơ đồ mô tả quy trình tái sinh phục vụ chuyển gen ở

cây đậu tƣơng ĐT12

98

Hình 3.25 Quy trình chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12 100

Hình 3.26 Các cây đậu tƣơng chuyển gen thế hệ T0 đƣợc trồng

trong nhà lƣới

101

Hình 3.27 Phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen mang đoạn gen

HA1 ở thế hệ T0

102

Hình 3.28 Phân tích sản phẩm PCR bằng cặp mồi đặc hiệu XhoI￾HA/ HindIII-HA với các dòng cây đậu tƣơng thế hệ T1

104

Hình 3.29 Hình ảnh protein HA1 hiện phim đƣợc phân tích bằng

Western blot từ protein tổng số chiết từ hạt của dòng

đậu tƣơng chuyển gen H11.

105

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế

giới đã có hơn nửa tỷ ngƣời mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng

virus nguy hiểm nhất ở ền trên 40 quốc gia ở châu Á,

Trung đông, châu Âu và châu Phi ớc ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra

từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn

nuôi gia cầm và ảnh hƣởng đến sức khoẻ con ngƣời. Việt Nam và Indonesia

là hai quốc gia có số ngƣời nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao

nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ

bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và

khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra.

Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm

A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cƣ và

thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus

cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống

dịch nhƣ tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy

cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hƣớng thiết yếu nhất để khống

chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang ngƣời. Ngoài các loại vaccine truyền

thống, vaccine thế hệ mới đƣợc tạo ra bằng các phƣơng pháp tái tổ hợp và di

truyền ngƣợc đang đƣợc sử dụng rộng rãi, tuy nhiên,

nhƣ mức độ an toàn thấp ,

các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine

mới có tính ƣu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn.

Vaccine ăn đƣợc từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2

thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính

tƣơng tự nhƣ vaccine thông thƣờng, chỉ khác là vaccine này đƣợc thực vật sản

xuất trong những phần ăn đƣợc nhƣ lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có

một số ƣu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tƣơi hoặc

nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lƣợng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây

chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật ổn

định, , dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế.

Ở Việt Nam, đậu tƣơng là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tƣơng là

nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con ngƣời. Sự biểu hiện thành công

gen gus trên cây đậu tƣơng là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để

sản xuất các chất có dƣợc tính nhƣ vaccine trong hạt đậu tƣơng. Với ƣu điểm

nổi bật nhƣ sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh

và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật đƣợc xem là hƣớng đi phù hợp

trong chiến lƣợc chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên

cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương

phục vụ sản xuất vaccine thực vật”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế đƣợc vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus

cúm A/H5N1.

Tạo đƣợc cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và

biểu hiện đƣợc protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tƣơng.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1 có khả năng biểu hiện tối

ƣu ở thực vật, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn

E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1.