Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virut H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN

BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN

BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ

2. GS. TS. CHU HOÀNG MẬU

THÁI NGUYÊN - 2014

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết

quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày

trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các Tạp chí khoa

học chuyên ngành và trong Kỷ yếu Hội nghị Khoa học-Công nghệ với sự

đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thu Hiền

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu

Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, xin chân

thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào

thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh

nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án.

Xin cảm ơn sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu và các đồng nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm cùng tập thể cán

bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận án.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-Kỹ thuật Nông nghiệp và Phòng

Quản lý sau đại học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, xin

cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Sư phạm và lãnh đạo Đại học Thái Nguyên.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban chủ nhiệm khoa Khoa

học cơ bản, Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thu Hiền

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU......................................................................................................................................................................................1

1. Đặt vấn đề..............................................................................................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................................................................................2

3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................................................................................2

4. Những đóng góp mới của luận án................................................................................................................3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.........................................................................................................................4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................................................5

1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1.......................................................5

1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1...................................................................5

1.1.2. Virus cúm A/H5N1............................................................................................................................................6

1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1............................................................ 19

1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1..................................................... 19

1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1................... 22

1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN

XUẤT VACCINE THỰC VẬT............................................................................................................................ 27

1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương.............................................................................. 27

1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong chọn giống đậu tương.................38

1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực

vật...................................................................................................................................................................................................... 43

Chương 2: VẬT LIỆ H ƠN H N HI N C .............................. 48

2.1. VẬT LIỆU................................................................................................................................................................... 48

.1.1. Nguyên liệu thực vật.................................................................................................................................... 48

.1. . Chủng vi khu n và các loại vector................................................................................................ 48

2.1.3. Hóa chất..................................................................................................................................................................... 48

2.1.4. Thiết bị........................................................................................................................................................................ 48

iv

. . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................................................... 49

2.2.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen.................................. 50

. . . Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in

vitro................................................................................................................................................................................................... 56

. . . Phương pháp phân tích cây chuyển gen.................................................................................. 61

. . ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN............................ 62

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U VÀ THẢO LUẬN......................................... 63

3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN

GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1......................................................................................................................... 63

3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA...................................................... 63

3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1................................... 77

3.2.HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN THÔNG

QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG............................. 85

3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tương

ĐT1 và DT84..................................................................................................................................................................... 86

3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tương thông qua vi khu n................ 94

3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tương........................... 99

3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG....101

3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tương

chuyển gen ở thế hệ T0.............................................................................................................................................101

. . . Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 .............................103

KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ.............................................................................................................................107

C C B I B O ĐÃ CÔN BỐ LI N Q AN ĐẾN LUẬN ÁN........................109

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................................................110

v

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

AS Acetosyrigone

A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

BAP 6-benzyladenine purin

bp Base pair

CCM Cocultivation medium

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

đtg Đồng tác giả

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli Escherichia coli

GA3 Gibberellic acid

GM Môi trường nảy mầm

gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

IAA Indoleacetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

kb Kilo base

LB Luria and Bertani

MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

NAA α-Naphthaleneacetic acid

nptII Neomycin phosphotransferase gene

OD Optical density

PCR Polymerase Chain Reaction

PPT Phosphinothricin

RM Môi trường ra rễ

SDS Sodium dodecylsulfat

vi

SIM Môi trường tạo chồi

SEM Môi trường kéo dài chồi

Taq Thermus Aquaticus

T-DNA Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

Ti- plasmid Plasmid tạo khối u

T0, T1, T2 Các thế hệ cây đậu tương chuyển gen

T0 Cây đậu tương chuyển gen tái sinh từ chồi

T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1

T2 Hạt của cây chuyển gen T1 nảy mầm thành cây T2

Vir Virulence Region

v/p vòng/phút

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

YEP Yeast extract peptone

vii

DANH MỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 50

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 50

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ligation 52

Bảng 2.4 Thành phần hóa chất tách plasmid 52

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng LR 54

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế 55

Bảng 2.7 Thành phần môi trường nuôi khu n 56

Bảng 2.8 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy in vitro 57

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA 66

Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1 78

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy

mầm hạt

86

Bảng 3.4 ết quả tái sinh đa chồi trên các môi trường chứa AP

nồng độ khác nhau

89

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của GA và IAA đến khả năng kéo dài chồi 91

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của I A đến khả năng tạo rễ 92

Bảng 3.7 Kết quả chuyển gen gus vào nách lá mầm đậu tương

thông qua vi khu n A. tumefacines

95

Bảng 3.8 Khả năng tái sinh thông qua nách lá mầm của giống đậu

tương ĐT1 sau khi biến nạp cấu trúc gen HA1

100

viii

DANH MỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

Hình 1.1 Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein

của virus cúm A/H5N1

11

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc protein Hemagglutinin 15

Hình 1.3 Sơ đồ xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ 18

Hình 1.4 Khối u thực vật do A. tumefaciens 30

Hình 1.5 Cấu trúc Ti- Plasmid 32

Hình 1.6 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens 34

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 49

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương 59

H nh 3 Trình tự A và cấu trúc của đoạn gen nhân tạo

(SLHEP) (B)

64

Hình 3.2 Trình tự gen HA đã được thay đổi mã bộ ba HAop) 65

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA

67

Hình 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra sản ph m thôi gel 68

Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector

p201-SLEHP tạo p201-SLEHP-HA/HA1

69

Hình 3.6 Hình ảnh khu n lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp

vào E.coli

70

Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid

tái tổ hợp p201-SLHEP-HA

71

ix

H nh 3 Sơ đồ thiết kế cấu trúc p 1-HA HA1vào vector

pPhaso-dest tạo pPhaso-dest-HA/HA1

72

H nh 3 Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pPhaso-HAop 73

H nh 3 Hình ảnh điện di sản ph m PCR kiểm tra vector biến

nạp trong chủng A. tumefaciens CV58

75

Hình 3.11 Sơ đồ mô tả sự tái sinh và chuyển gen HA ở cây thuốc lá 76

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản ph m PCR kiểm tra gen chuyển

HA trong cây thuốc lá

77

Hình 3.13 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

HA1 bằng XhoI-HA1/HindIII-HA1

78

Hình 3.14 Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của

đoạn gen HA1

80

Hình 3.15 Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid

tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1

81

H nh 3 Hình ảnh điện di kiểm tra vector chuyển gen mang cấu

trúc pPhaso-SLEHP-HA1

82

H nh 3 Hình ảnh điện di sản ph m PCR kiểm tra vector biến

nạp trong chủng CV5

84

H nh 3 Kết quả điện di sản ph n PCR kiểm tra cây thuốc lá

chuyển gen HA1

85

Hình 3.19 Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau 88

Hình 3.20 Cụm chồi tạo được sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM 90

Hình 3.21 Cụm chồi trên môi trường kéo dài SEM 91

H nh 3 22 Đậu tương tái sinh đa chồi A và chọn lọc cây chuyển 95

x

gen trên môi trường chứa kháng sinh kanamycine

H nh 3 23 Hình ảnh kết quả nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hiện

gen gus trên cây đậu tương chuyển gen

96

Hình 3.24 Sơ đồ mô tả quy trình tái sinh phục vụ chuyển gen ở

cây đậu tương ĐT1

98

Hình 3.25 Quy trình chuyển gen ở giống đậu tương ĐT1 100

Hình 3.26 Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 được trồng

trong nhà lưới

101

Hình 3.27 Phân tích cây đậu tương chuyển gen mang đoạn gen

HA1 ở thế hệ T0

102

Hình 3.28 Phân tích sản ph m PCR bằng cặp mồi đặc hiệu XhoI￾HA/ HindIII-HA với các dòng cây đậu tương thế hệ T1

104

Hình 3.29 Hình ảnh protein HA1 hiện phim được phân tích bằng

Western blot từ protein tổng số chiết từ hạt của dòng

đậu tương chuyển gen H11.

105

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế

giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng

virus nguy hiểm nhất ở gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á,

Trung đông, châu Âu và châu Phi. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra

từ những tháng cuối năm gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn

nuôi gia cầm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Việt Nam và Indonesia

là hai quốc gia có số người nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao

nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ

bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và

khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra.

Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm

A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và

thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus

cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống

dịch như tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy

cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống

chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người. Ngoài các loại vaccine truyền

thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di

truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi, tuy nhiên, các loại vaccine này có

nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp. Do vậy,

các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine

mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn.

Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ

2

thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính

tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản

xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có

một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc

nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây

chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ổn

định, an toàn cao, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế.

Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là

nguồn thực ph m chính cho vật nuôi và con người. Sự biểu hiện thành công

gen gus trên cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để

sản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương. Với ưu điểm

nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh

và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp

trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên

cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương

phục vụ sản xuất vaccine thực vật”

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus

cúm A/H5N1.

Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và

biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1 có khả năng biểu hiện tối

ưu ở thực vật, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khu n

E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1.