Nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và sự tồn lưu dioxin trên các đối tượng phơi nhiễm có nguy cơ cao- Đề tài nhánh 1: Nghiên cứu những biến đổi di truyền ở các đối tượng bị ảnh hưởng do phơi nhiễm với chất độc hóa học trong chiến tranh và các thế hệ tiếp theo (F!,F2) của họ

bé y tÕ ch−¬ng tr×nh 33

tr−êng ®¹i häc y hµ néi

b¸o c¸o

tæng kÕt ®Ò tµi nh¸nh

Nghiªn cøu nh÷ng biÕn ®æi di truyÒn (nhiÔm s¾c thÓ) ë c¸c

®èi t−îng bÞ ¶nh h−ëng do ph¬i nhiÔm víi chÊt ®éc hãa häc

trong chiÕn tranh vµ c¸c thÕ hÖ tiÕp theo (F1, F2) cña hä.

CHñ NHIÖM §Ò TµI NH¸NH: Gs. TrÞnh V¨n B¶o

thuéc ®Ò tµi cÊp nhµ n−íc:

nghiªn cøu c¸c biÕn ®æi vÒ mÆt di truyÒn, miÔn DÞch,

sinh ho¸, huyÕt häc vµ tån l−u dioxin

trªn c¸c ®èi t−îng ph¬i nhiÔm cã nguy c¬ cao.

chñ nhiÖm ®Ò tµi: pgs.ts NguyÔn v¨n T−êng

C¥ QUAN CHñ QU¶N: bé Y TÕ

c¬ quan CHñ TR× : TR¦êNG §¹I HäC Y Hµ NéI

hµ néi – 2003

5462-1

13/10/2005

0

®Æt vÊn ®Ò

Trong cuéc chiÕn tranh ë ViÖt Nam, qu©n ®éi Mü ®· sö dông c¸c chÊt

®éc ho¸ häc, trong ®ã chñ yÕu lµ c¸c chÊt diÖt cá vµ lµm rông l¸. ChÊt ®éc

ho¸ häc ®· sö dông tõ n¨m 1961 ®Õn n¨m 1972 trong chiÕn dÞch Ranch

Hand. Trong thêi gian nµy h¬n 70.720m3

chÊt diÖt cá vµ lµm rông l¸ ®·

®−îc r¶i xuèng miÒn Nam ViÖt Nam víi tæng diÖn tÝch bÞ r¶i chiÕm 10%

tæng diÖn tÝch miÒn Nam ViÖt Nam. Kho¶ng 15 lo¹i ho¸ chÊt ®· ®−îc dïng

trong ®ã cã h¬n 42 triÖu lÝt chÊt da cam. Trong chÊt da cam, ngoµi 2,4 - D

vµ 2,4,5 - T lµ hai thµnh phÇn chÝnh, cßn cã t¹p chÊt 2,3,7,8 - tetrachloro

dibenzo paradioxin cßn gäi t¾t lµ dioxin. Dioxin lµ mét chÊt cùc ®éc. Tæng

l−îng dioxin ®· r¶i xuèng miÒn Nam ViÖt Nam theo sè liÖu tr−íc ®©y

kho¶ng 170 kg trong chiÕn dÞch Ranch Hand; theo c«ng bè míi ®©y nhÊt,

l−îng Dioxin cã thÓ cao h¬n 2 – 4 lÇn so víi c«ng bè tr−íc ®©y [26] .

Hai cuéc héi th¶o quèc tÕ vÒ nhiÒu vÊn ®Ò kh¸c nhau liªn quan víi

chÊt diÖt cá, lµm rông l¸ vµ dioxin ®· ®−îc tæ chøc ë thµnh phè Hå ChÝ

Minh (1983) vµ ë Hµ Néi (1993). Héi nghÞ khoa häc ViÖt Mü vÒ chÊt da

cam / dioxin d· ®−îc tæ chøc vµo th¸ng 3 n¨m 2002.

Ngay tõ nh÷ng ngµy ®Çu khi qu©n ®éi Mü sö dông chiÕn tranh ho¸

häc, mét sè nhµ khoa häc ViÖt Nam ®· nghiªn cøu ®¸nh gi¸ t¸c h¹i cña

cuéc chiÕn tranh nµy. Uû ban 10/80 tr−íc ®©y vµ Uû ban 33 hiÖn nay ®· vµ

®ang tiÕn hµnh c¸c cuéc ®iÒu tra vÒ hËu qu¶ vµ nghiªn cøu c¸c biÖn ph¸p ®Ó

kh¾c phôc hËu qu¶ cña cuéc chiÕn tranh ho¸ häc nµy.

Trong c¸c nghiªn cøu ®¸nh gi¸ t¸c h¹i cña chÊt ®éc, ®¸nh gi¸ ®ét biÕn

nhiÔm s¾c thÓ lµ mét trong c¸c nghiªn cøu sím nhÊt. T«n ThÊt Tïng vµ

B¹ch Quèc Tuyªn lµ nh÷ng ng−êi ViÖt Nam nghiªn cøu sím nhÊt vÒ vÊn ®Ò

nµy vµ ®· cã nh÷ng nhËn xÐt khoa häc rÊt cã gi¸ trÞ. Thêi gian sau ®ã, mét

sè t¸c gi¶ ViÖt Nam còng nh− n−íc ngoµi ®· tiÕp tôc nghiªn cøu vÊn ®Ò nµy.

KÓ tõ khi qu©n ®éi Mü ngõng r¶i chÊt ®éc ho¸ häc ë miÒn Nam ViÖt Nam

cho ®Õn nay ®· h¬n 30 n¨m. Cho ®Õn nay ý kiÕn cña c¸c nhµ khoa häc vÒ

vÊn ®Ò ®éc häc gen (genotoxic effect) cßn ch−a thèng nhÊt.

1

Víi nhËn thøc: ViÖt Nam ®· vµ ®ang chÞu ¶nh h−ëng nÆng nÒ cña

cuéc chiÕn tranh ho¸ häc do qu©n ®éi Mü thùc hiÖn, c¸c nghiªn cøu kü cµng

vµ ®ång bé nhiÒu mÆt t¸c h¹i vµ hËu qu¶ cña cuéc chiÕn tranh ®ã ®Ó cã

nh÷ng nhËn xÐt, kÕt luËn thùc tÕ ë ViÖt Nam nh»m ch¨m sãc, b¶o vÖ søc

khoÎ céng ®ång. Trong khu«n khæ ®Ò tµi cÊp nhµ n−íc "Nghiªn cøu c¸c

biÕn ®æi vÒ mÆt di truyÒn, miÔn dÞch, sinh hãa, huyÕt häc vµ tån l−u dioxin

trªn c¸c ®èi t−îng ph¬i nhiÔm cã nguy c¬ cao" ®Ò tµi nh¸nh "Nghiªn cøu

c¸c biÕn ®æi vÒ mÆt di truyÒn….." ®−îc thùc hiÖn víi môc tiªu sau:

1. X¸c ®Þnh tÇn sè c¸c d¹ng ®ét biÕn nhiÔm s¾c thÓ ë nhãm chøng vµ

nhãm ph¬i nhiÔm.

2. X¸c ®Þnh tÇn sè trao ®æi chromatid chÞ em ë nhãm chøng vµ nhãm

ph¬i nhiÔm.

3. X¸c ®Þnh bé nhiÔm s¾c thÓ ë mét sè ®èi t−îng bÞ dÞ tËt bÈm sinh.

2

I. tæng quan tµi liÖu

1.1. T¸c nh©n g©y ®ét biÕn.

C¸c t¸c nh©n trong m«i tr−êng bao gåm c¸c t¸c nh©n m«i tr−êng vÜ

m« vµ t¸c nh©n m«i tr−êng vi m«. Sù « nhiÔm cña m«i tr−êng toµn cÇu hay

ë tõng ®Þa ph−¬ng víi nh÷ng t¸c nh©n vËt lý, ho¸ häc, sinh häc kh¸c nhau

còng nh− nh÷ng bÊt th−êng tinh vi trong qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ vËt chÊt trong

c¬ thÓ, trong tÕ bµo ®Òu cã thÓ dÉn ®Õn nh÷ng bÊt th−êng cña c¬ thÓ. Sù tr¶

lêi cña c¬ thÓ ®èi víi nh÷ng thay ®æi ®ã trong ®a sè tr−êng hîp lµ sù thÝch

nghi ®Ó tån t¹i vµ ph¸t triÓn, nh−ng trong nhiÒu tr−êng hîp c¬ thÓ kh«ng

thÝch nghi ®−îc vµ nh÷ng bÊt th−êng cña c¬ thÓ xuÊt hiÖn trong ®ã cã nh÷ng

bÊt th−êng cña tÕ bµo:

- TÕ bµo bÞ chÕt.

- VËt chÊt di truyÒn trong tÕ bµo bÞ biÕn ®æi tõ ®ã dÉn ®Õn nh÷ng tÕ

bµo bÞ ®ét biÕn.

Cã thÓ xÕp c¸c t¸c nh©n ®éc h¹i trong m«i tr−êng thµnh ba nhãm:

- Nhãm c¸c t¸c nh©n g©y ®ét biÕn (Mutagens): G©y biÕn ®æi vËt liÖu

di truyÒn ë møc ®é nhiÔm s¾c thÓ hoÆc møc ®é gen.

- Nhãm c¸c t¸c nh©n g©y ung th− (Carcinogens): G©y nh÷ng biÕn ®æi

trong tÕ bµo dÉn ®Õn sù xuÊt hiÖn tÕ bµo ung th−.

- Nhãm c¸c t¸c nh©n g©y qu¸i thai (teratogens): T¸c ®éng vµo tÕ bµo

trong c¸c giai ®o¹n ph¸t triÓn ph«i thai dÉn ®Õn c¸c ph«i thai dÞ d¹ng.

§Æc ®iÓm vµ tÝnh chÊt cña c¸c chÊt g©y ®ét biÕn.

- C¸c chÊt g©y ®ét biÕn cã thÓ cã b¶n chÊt lµ nh÷ng t¸c nh©n vËt lý,

t¸c nh©n ho¸ häc hoÆc c¸c t¸c nh©n sinh häc. Danh môc c¸c t¸c nh©n g©y

®ét biÕn cµng ngµy cµng ®−îc bæ sung. §Æc ®iÓm chung cña c¸c chÊt g©y

®ét biÕn lµ cã kh¶ n¨ng g©y t¨ng sinh c¸c gèc tù do trong tÕ bµo. Mét ®Ých

quan träng cña c¸c gèc tù do lµ ADN cña tÕ bµo.

3

- C¸c chÊt g©y ®ét biÕn cã thÓ t¸c ®éng ®Õn tÕ bµo sinh d−ìng (soma)

hoÆc tÕ bµo sinh dôc (germ lines). Nh÷ng ®ét biÕn ë tÕ bµo sinh d−ìng chØ

tån t¹i trong ®êi c¸ thÓ bÞ ®ét biÕn, cßn nh÷ng ®ét biÕn ë tÕ bµo sinh dôc cã

thÓ di truyÒn cho c¸c thÕ hÖ tiÕp theo.

- §ét biÕn ë tÕ bµo sinh d−ìng hay tÕ bµo sinh dôc cã thÓ lµ nh÷ng

®ét biÕn gen hoÆc nh÷ng ®ét biÕn nhiÔm s¾c thÓ. Nh÷ng ®ét biÕn ®ã cã thÓ

lµ nh÷ng ®ét biÕn ë tõng gen, tõng nhiÔm s¾c thÓ riªng biÖt nh−ng còng cã

thÓ x¶y ra ë c¶ bé gen (genome).

- PhÇn lín c¸c ®ét biÕn sau khi x¶y ra ®−îc tù söa ch÷a ®Ó trë l¹i

tr¹ng th¸i b×nh th−êng, mét sè kh«ng tù söa ch÷a ®−îc cã thÓ dÉn ®Õn

nh÷ng biÕn ®æi cña kiÓu h×nh ë nh÷ng møc ®é kh¸c nhau.

1.2. §ét biÕn nhiÔm s¾c thÓ.

Nh− ®· biÕt nhiÔm s¾c thÓ chØ h×nh thµnh râ rÖt khi tÕ bµo ph©n chia,

cßn tÕ bµo ë gian kú (interphasis) trong nh©n tÕ bµo chØ cã thÓ quan s¸t thÊy

chÊt nhiÔm s¾c (chromatine).

Vµo n¨m 1956 Tjio vµ Levan [28] ®· x¸c ®Þnh chÝnh x¸c sè l−îng

nhiÔm s¾c thÓ ë tÕ bµo soma cña ng−êi lµ 2n = 46. N¨m 1960 Moorhead vµ

céng sù [19] ®· ®Ò xuÊt ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo lympho ë m¸u ngo¹i

vi cña ng−êi ®Ó quan s¸t nhiÔm s¾c thÓ víi sù sö dông PHA

(Phytohemagglutinin) ®−îc chiÕt xuÊt tõ Phaseolus vulgaris ®Ó kÝch thÝch

chuyÓn d¹ng lympho bµo. Tõ ®ã ®Õn nay, ph−¬ng ph¸p nµy ®−îc sö dông

réng r·i trong c¸c phßng di truyÒn tÕ bµo ®Ó nghiªn cøu nhiÔm s¾c thÓ víi

nh÷ng c¶i tiÕn nhá tuú tõng phßng thÝ nghiÖm.

1.2.1. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu nhiÔm s¾c thÓ.

1.2.1.1. Nghiªn cøu nhiÔm s¾c thÓ ë gian kú.

Nh− ®· nªu ë trªn, ë gian kú nhiÔm s¾c thÓ tån t¹i ë d¹ng chÊt nhiÔm

s¾c. §· cã ph−¬ng ph¸p chÝnh ®−îc ®Ò xuÊt ®Ó nghiªn cøu NST ë gian kú

nµy:

4

- Kü thuËt ph¸t hiÖn vËt thÓ Barr: ph¸t hiÖn chÊt nhiÔm s¾c giíi tÝnh

(biÓu hiÖn cho mét NST X kh«ng ho¹t ®éng sinh lý) ®Ó tham gia x¸c ®Þnh sù

bÊt th−êng cña cÆp NST giíi tÝnh.

- Kü thuËt ph¸t hiÖn vËt thÓ Y: ph¸t hiÖn vïng chÊt nhiÔm s¾c b¾t mµu

huúnh quang ®Ëm cña NST Y ®Ó tham gia x¸c ®Þnh sù bÊt th−êng cña NST

Y.

- Kü thuËt lai t¹i chç huúnh quang (FISH): ph¸t hiÖn sù bÊt th−êng

cña mét NST nµo ®ã tïy thuéc vµo Kit ®−îc dïng.

1.2.1.2. Nghiªn cøu NST ë tÕ bµo ®ang ph©n chia.

§©y lµ ph−¬ng ph¸p chñ yÕu ®Ó nghiªn cøu ®ét biÕn NST.

TÕ bµo th−êng ®−îc dïng ®Ó nghiªn cøu NST lµ tÕ bµo lympho ë m¸u

ngo¹i vi. Ngoµi ra, ng−êi ta cßn dïng tÕ bµo tuû x−¬ng, tÕ bµo bµo thai, tÕ

bµo trong dÞch èi, tÕ bµo tua rau thai, tÕ bµo m¸u cuèng rèn…Yªu cÇu cña

kü thuËt lµ

- Cã nhiÒu tÕ bµo ®ang ph©n chia.

- C¸c tÕ bµo tån t¹i ë d¹ng kú gi÷a (metaphase) hoÆc gi÷a kú ®Çu vµ

kú gi÷a (prometaphase) ®Ó cã thÓ ph©n tÝch ë kÝnh hiÓn vi quang häc.

- Vµ cã c¸ch nhuém NST thÝch hîp ®Ó cã thÓ ph©n tÝch c¸c ®Æc ®iÓm

cÇn ph©n tÝch.

- Nhuém NST theo ph−¬ng ph¸p nhuém giemsa th«ng th−êng.

Ph−¬ng ph¸p nhuém nµy ®−îc hÇu hÕt c¸c phßng thÝ nghiÖm di

truyÒn tÕ bµo ¸p dông v× ®¬n gi¶n, NST hiÖn râ nÐt, cã thÓ ph©n biÖt râ c¸c

tæn th−¬ng nhá cña NST nh− c¸c ®øt ®¬n (break) hoÆc c¸c chç nh¹t (gap).

Tuy nhiªn, ph−¬ng ph¸p nhuém nµy trong nhiÒu tr−êng hîp kh«ng ®ñ ®Ó

x¸c ®Þnh vÞ trÝ chÝnh x¸c cña c¸c NST, nhÊt lµ c¸c NST gièng nhau nh− NST

nhãm C, nhãm D…

- Nhuém b¨ng (Banding techniques).

Sù ph©n bè c¸c chÊt dÞ nhiÔm s¾c (heterochromtine) vµ nhiÔm s¾c

thùc (euchromatine) lµ ®Æc tr−ng cho tõng NST. Khi xö lý NST b»ng c¸c

ph−¬ng ph¸p xö lý vµ nhuém kh¸c nhau trªn c¸c NSt sÏ hiÖn lªn c¸c b¨ng

sÉm vµ nh¹t, c¸c b¨ng nµy ®Æc tr−ng cho tõng NST vµ do vËy cã thÓ x¸c

5

®Þnh chÝnh x¸c vÞ trÝ cña tõng NST, tuú theo c¸ch xö lý vµ nhuém mµ cã tªn

t−¬ng øng cña c¸c kü thuËt b¨ng: B¨ng G, sau khi xö lý NST ®−îc nhuém

b»ng giemsa; b¨ng Q, sau khi xö lý, NST ®−îc nhuém b»ng phÈm nhém

huúnh quang (Quinacrine hoÆc Quanacrine mustard); b¨ng C: NST ®−îc

nhuém ë phÇn t©m (centromere); b¨ng R: sù ph©n bè cña c¸c b¨ng sÉm vµ

nh¹t ng−îc l¹i víi b¨ng G.

- ¸p dông kü thuËt FISH víi NST ë metaphase hoÆc intermetaphase.

Th−êng ®−îc dïng ®Ó x¸c ®Þnh mét kiÓu h×nh bÊt th−êng nµo ®ã

t−¬ng øng víi kit ADN ®· cã. Sù bæ sung cña ADN ®Ých trªn NST víi kit

ADN sÏ ®−îc ph¸t hiÖn b»ng ph−¬ng ph¸p lai t¹i chç víi c¸c lo¹i phÈm

nhuém huúnh quang thÝch hîp.

- ¸p dông kü thuËt nh©n nhá ë tÕ bµo lympho cña ng−êi

(Micronucleus test)

Kü thuËt nµy ®−îc Countryman vµ Headle ®Ò xuÊt vµo n¨m 1976 [8].

Nh©n nhá ®−îc h×nh thµnh do sù kÕt ®Æc cña c¸c ®o¹n NST bÞ ®øt

kh«ng mang t©m ®éng, hoÆc do cã c¸c NST bÞ thÊt l¹c trong qu¸ tr×nh di

chuyÓn ë kú sau. Cã thÓ nãi nh©n nhá lµ h×nh ¶nh cña c¸c rèi lo¹n cÊu tróc

vµ rèi lo¹n NST x¶y ra trong lÇn ph©n bµo tr−íc. Nh©n nhá chØ biÓu hiÖn ë

c¸c tÕ bµo ®ang ph©n chia. Nh©n nhá cã thÓ quan s¸t thÊy ë tÕ bµo t¹o hång

cÇu cña tuû, ë tÕ bµo lympho. Víi viÖc dïng cytochalasin B ®Ó øc chÕ sù

ph©n chia cña tÕ bµo chÊt cã thÓ quan s¸t c¸c nh©n nhá (nÕu cã ®ét biÕn) ë

c¸c tÕ bµo cã hai nh©n.

1.2.1.3. Ph−¬ng ph¸p trao ®æi chromatid chÞ em (Sister Chromatid

Exchange = SCE).

Ph−¬ng ph¸p nµy ®−îc Perry vµ cs ®Ò xuÊt vµo n¨m 1974.

B»ng c¸ch dïng 5 - Bromodeoxyuridin (5 - BrdU) vµ c¸c tiÒn xö lý ®Ó

nhuém hai chromatid chÞ em, tõ ®ã quan s¸t thÊy c¸c trao ®æi gi÷a hai

chromatid cò vµ míi. Sù trao ®æi nµy thÓ hiÖn c¸c biÕn ®æi bªn trong NST ë

c¸c locus t−¬ng ®ång cña hai chromatid bao gåm sù ®øt ra vµ nèi l¹i cña

tõng phÇn cña hai chromatid chÞ em trong chu kú tÕ bµo. TÇn sè trao ®æi

6