Nghiên cứu bệnh lá vàng greening hại cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và đề xuất biện pháp phòng chống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ MAI NHẤT

NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LÁ GREENING

HẠI CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ MAI NHẤT

NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LÁ GREENING

HẠI CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Mã số: 62.62.01.12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Ngô Vĩnh Viễn

2. PGS.TS. Nguyễn Văn Viết

Hà Nội, 2014

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công

trình nào khác.

Hà Nội, ngày 8 tháng 6 năm 2014

Tác giả luận án

Lê Mai Nhất

ii

LỜI CẢM ƠN!

Để hoàn thành bản luận án này, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ về mọi mặt

của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân.

Trước hết tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới

TS. Ngô Vĩnh Viễn và PGS.TS. Nguyễn Văn Viết, những người thầy đã tận tình

chỉ bảo, hướng dẫn về chuyên môn cũng như phương pháp luận trong suốt quá

trình thực hiện đề tài và luôn chia sẻ, động viên để tôi hoàn thành luận án này.

Luận án được thực hiện tại Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật và

một số vùng trồng cây ăn quả có múi ở miền Bắc, Việt Nam. Tôi đã nhận được

sự giúp đỡ của Ban Lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật; Tập thể cán bộ Bộ môn

Bệnh cây; Phòng Khoa học và hợp tác quốc tế trong suốt quá trình thực hiện đề

tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quí báu đã dành cho

tôi.

Tôi xin gửi lời cảm ơn GS. Hong Ji Su luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi về

vật tư, hóa chất và đã chỉ cho tôi các hướng nghiên cứu mới về bệnh cây, luôn

chia sẻ kinh nghiệm đồng thời đã tìm nguồn kinh phí để giúp tôi học tập và làm

thí nghiệm tại Trường Đại học tổng hợp Đài Loan, tham dự Hội nghị quốc tế về

bệnh Huanglongbing.

Chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong nhóm nghiên cứu về bệnh

hại cây ăn quả có múi, nơi mà tôi đã từng công tác trong nhiều năm, cũng là nơi

sinh hoạt chuyên môn của tôi đã luôn chia sẻ kinh nghiệm quý báu trong nghiên

cứu và giúp đỡ tôi trên mọi phương diện.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt

Nam, Ban Đào tạo Sau đại học cùng tập thể cán bộ và quý thầy cô đã giúp đỡ

trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.

Xin ghi nhận nơi đây tình cảm yêu thương của vợ, con, cha mẹ, anh chị

em và toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn hết lòng động viên tinh thần trong

suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án.

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Mai Nhất

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Dang mục các chữ viết tắt iv

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài 1

2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4

5. Những đóng góp mới của luận án 4

CHƯƠNG I

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

1.1. Cơ sở khoa học của đề tài 5

1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6

1.2.1. Nguôn gốc và phân loại cây ăn quả có múi 6

1.2.2. Nghiên cứu về bệnh vàng lá greening 6

1.2.2.1. Triệu chứng, lịch sử phát hiện, phân bố của bệnh vàng lá

greening

6

1.2.2.2. Chẩn đoán và giám định bệnh vàng lá greening 11

1.2.3. Nghiên cứu về dịch tễ và sinh thái học của bệnh vàng lá greening 14

iii

1.2.3.1. Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening 14

1.2.3.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái của rầy chổng cánh Diaphorina

citri Kuwayama

15

1.2.3.3. Nghiên cứu về ký chủ của rầy chổng cánh Diaphorina citri và

vi khuẩn Liberibacter asiaticus

19

1.2.4. Nghiên cứu các giải pháp quản lý bệnh vàng lá greening 20

1.2.4.1. Mối quan hệ giữa phân bón với sinh trưởng và năng suất 20

1.2.4.2. Sử dụng cây giống sạch bệnh 21

1.2.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của cây gốc ghép đến sản xuất

cây ăn quả có múi

23

1.2.4.4. Trồng xen ổi trong vườn cây ăn quả có múi 23

1.2.4.5. Biện pháp sinh học trong phòng trừ côn trùng môi giới

(Diaphorina citri Kuwayama)

24

1.2.4.6. Biện pháp hóa học trong phòng trừ côn trùng môi giới

(Diaphorina citri Kuwayama)

24

1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước 26

1.3.1. Cây ăn quả có múi ở Việt Nam và thành phần sâu bệnh hại 26

1.3.2. Nghiên cứu về bệnh vàng lá greening và nguyên nhân gây bệnh 28

1.3.2.1. Lịch sử và sự phân bố của bệnh vàng lá greening 28

1.3.2.2. Triệu chứng bệnh vàng lá greening 28

1.3.2.3. Chẩn đoán và giám định bệnh vàng lá greening 30

1.3.3. Nghiên cứu về dịch tễ học của bệnh vàng lá greening 30

1.3.3.1. Nghiên cứu về sự lan truyền bệnh vàng lá greening 30

1.3.3.2. Nghiên cứu về ký chủ của rầy chổng cánh Diaphorina citri và

vi khuẩn Liberibacter asiaticus

31

1.3.4. Nghiên cứu các giải pháp quản lý bệnh vàng lá greening 33

iii

1.3.4.1. Sử dụng cây giống sạch bệnh 33

1.3.4.2. Biện pháp cánh tác và cải thiện giống cây ăn quả có múi 35

1.3.4.3. Biện pháp sinh học trong phòng trừ côn trùng môi giới

(Diaphorina citri Kuwayama)

37

1.3.4.4. Biện pháp hóa học trong phòng trừ côn trùng môi giới

(Diaphorina citri Kuwayama)

39

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

41

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 41

2.2. Vật liệu nghiên cứu 41

2. 3. Nội dung nghiên cứu 42

2.4. Phương pháp nghiên cứu 42

2.4.1. Phương pháp nghiên cứu mức độ phổ biến và triệu chứng

của bệnh vàng lá greening

42

2.4.1.1. Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh và mức độ phổ biến

trên đồng ruộng

42

2.4.1.2. Phương pháp xác định các dạng triệu chứng bệnh vàng lá

greening trên cây ăn quả có múi ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

43

2.4.1.3. Phương pháp điều tra rầy chổng cánh (Diaphorina citri

Kuwayama) trên cây ăn quả có múi

44

2.4.2. Phương pháp nghiên cứu giám định tác nhân gây bệnh

và sự lan truyền bệnh vàng lá greening

44

2.4.2.1. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh bằng hiển vi điện tử 44

2.4.2.2. Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening 45

iii

bằng sinh học phân tử

2.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening

qua hạt giống

46

2.4.2.4. Phương pháp nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening

qua nhân giống vô tính

47

2.4.2.5. Phương pháp nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening

bằng môi giới rầy chổng cánh (Diaphorina citri Kuwayama)

47

2.4.3. Phương pháp nghiên cứu xác định ký chủ và sự phân bố của các

chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở một

số tỉnh phía Bắc Việt Nam

49

2.4.3.1. Phương pháp xác định ký chủ của bệnh vàng lá greening 49

2.4.3.2. Phương pháp đánh giá mức độ nhiễm các mẫu bệnh vàng lá

greening của các chủng loại cây có múi khác nhau

50

2.4.3.3. Phương pháp xác định các chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá

greening

51

2.4.3.4. Phương pháp cải tiến tách chiết DNA dùng trong chẩn đoán

bệnh vàng lá greening bằng sinh học phân tử

52

2.4.4. Phương pháp nghiên cứu các giải pháp phòng chống bệnh vàng lá

greening

52

2.4.4.1. Phương pháp vi ghép đỉnh sinh trưởng 52

2.4.4.2. Phương pháp nghiên cứu làm tăng tỷ lệ sống và sạch bệnh trong

vi ghép đỉnh sinh trưởng

53

2.4.4.3. Phương pháp cải tiến trong vi ghép đỉnh sinh trưởng 54

2.4.4.4. Phương pháp sản xuất cây giống sạch bệnh 54

2.4.4.5. Phương pháp đánh giá tính chống chịu của gốc ghép hiện đang 58

iii

sử dụng trong sản xuất cây giống đối với bệnh vàng lá greening

2.4.4.6. Phương pháp nghiên cứu chống tái nhiễm bệnh vàng lá

greening trên đồng ruộng

58

2.5. Xử lý số liệu thí nghiệm 59

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

60

3.1. Mức độ phổ biến và triệu chứng của bệnh vàng lá greening 60

3.1.1. Hiện trạng sử dụng giống cây ăn quả có múi tại Hà Nội và Hòa

Bình

60

3.1.2. Mức độ phổ biến của bệnh vàng lá greening tại các vùng điều tra 62

3.1.3. Mức độ nhiễm bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại cây

có múi ở các vùng sinh thái

64

3.1.4. Mức độ nhiễm bệnh vàng lá greeining hỗn hợp với các bệnh vi

rút, viroid trên cây ăn quả có múi

66

3.1.5. Xác định nhóm triệu chứng bệnh vàng lá greening qua phân tích

bằng sinh học phân tử

68

3.1.6. Kiểm chứng khả năng nhiễm bệnh vàng lá greening trên đồng

ruộng dựa trên triệu chứng đã xác định

73

3.1.7. Cải tiến phương pháp tách chiết thô DNA trong chẩn đoán bệnh

vàng lá greening trên cây ăn quả có múi

77

3.2. Xác định tác nhân gây bệnh và sự lan truyền bệnh vàng lá greening 79

3.2.1. Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá greening bằng hiển vi điện tử 79

3.2.2. Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá greening bằng sinh học phân

tử

81

iii

3.2.3. Khả lan truyền của bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi 82

3.2.3.1. Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening qua hạt giống 82

3.2.3.2. Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening qua nhân giống

vô tính

84

3.2.3.3. Nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening qua rầy chổng

cánh Diaphorina citri Kuwayama

86

3.2.3.4. Mật độ rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama trên cây ăn

quả có múi

91

3.3. Nghiên cứu xác định ký chủ và sự phân bố của các chủng vi khuẩn

gây bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở phía Bắc Việt Nam

96

3.3.1. Ký chủ của bệnh vàng lá greening 96

3.3.2. Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening qua phản ứng

của một số chủng loại cây ăn quả có múi với nguồn bệnh

98

3.4. Nghiên cứu các biện pháp phòng chống bệnh vàng lá greening 112

3.4.1. Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng tạo cây đầu

dòng sạch bệnh

113

3.4.1.1. Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật tạo cây gốc ghép lần 1 trong vi

ghép đỉnh sinh trưởng

113

3.4.1.2. Nghiên cứu cải tiến môi trường lỏng để nuôi cây vi ghép lần 1 117

3.4.1.3. Biện pháp làm tăng tỷ lệ sạch bệnh vàng lá greening đối với cây

có múi

120

3.4.1.4. Ảnh hưởng của tuổi cây vi ghép lần 1 đến sự sinh trưởng và

phát triển của cây vi ghép lần 2

122

3.4.2. Sản xuất cây giống có múi sạch bệnh trong hệ thống nhà lưới 3

cấp

125

iii

3.4.3. Tính chống chống chịu của gốc ghép hiện đang sử dụng trong sản

xuất cây giống với bệnh vàng lá greening

131

3.4.3.1. Tính chống chịu của gốc ghép (Bưởi chua, chấp) với bệnh vàng

lá greening

131

3.4.3.2. Tính chống chống chịu của gốc ghép nhập nội với bệnh vàng lá

greening

135

3.4.4. Nghiên cứu chống tái nhiễm bệnh vàng lá greening trên đồng

ruộng

137

3.4.4.1. Xử lý mắt ghép bị bệnh bằng kháng sinh 137

3.4.4.2. Hiệu quả chống tái nhiễm bệnh vàng lá greening trên đồng

ruộng ở các điều kiện quản lý khác nhau

138

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 145

1. Kết luận 145

2. Đề nghị 146

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 147

TÀI LIỆU THAM KHẢO 148

PHỤ LỤC

iv

DANH MUC VIẾT TẮT

BAP 6-Benzyl amino purin

CEVd Bệnh exocortis (Citrus exocortis viroid)

CLTV Bệnh tatter leaf (Citrus tatter leaf capillovirus)

CS Cộng sự

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

CTV Bệnh tristeza (Citrus tristeza closterovirus)

EDTA Ethylene diammine tetraacetic acid

DNA Deoxyribonucleic acid

DNA-extraction (pH 8,0): 100mM Tris-HCL, 100mM EDTA

EM Electron microscope

FFTC Food and Fertilizer Technology Centre

IOCV International Organization Citrus Virologist

Iodine Kit KI 3%; I2 1,5%

dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates

Loading buffer 0,25% bromphenol blue, 30% glycerol theo tỷ lệ 1:4

MgCl2 Magnesium chloride

MS Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction

RCC Rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama

RT-PCR Reverse-transcription polymerase chain reaction

STG Vi ghép đỉnh sinh trưởng (Shoot-tip micrografting)

TAE buffer Tris acetate EDTA buffer

0,5 TAE buffer/l 242 gam Tris base; 57,1 ml Glacial acetic acid; 100ml 0,5 M

EDTA (pH 8,0)

TE buffer

(pH8,0)

10mM Tris, 1mM EDTA

VLG Vàng lá greening

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

3.1 Hiện trạng sản xuất, sử dụng giống cây có múi tại Hà Nội và Hoà

Bình, năm 2010

61

3.2 Mức độ phổ biến bệnh vàng lá greening trên cây có múi ở một số

vùng điều tra (2010 – 2012)

63

3.3 Số mẫu bệnh vàng lá greening thu thập trên các giống điều tra ở

bốn vùng sinh thái khác nhau (2010 - 2012)

65

3.4 Tỷ lệ bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại cây ăn quả có

múi ở phía Bắc Việt Nam (2010 – 2012)

66

3.5 Kết quả xác định sự hiện diện của bệnh vàng lá greening và một

số bệnh vi rút hại cây có múi trên cùng một mẫu bệnh bằng sinh

học phân tử (tại Viện Bảo vệ thực vật, 2010 – 2012)

67

3.6 Kết quả giám định một số nhóm triệu chứng bệnh vàng lá

greening trên cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật PCR (Viện Bảo vệ

thực vật năm 2010 – 2012)

69

3.7 Kết quả giám định nhóm triệu chứng bệnh hỗn hợp giữa vàng lá

greening với bệnh tristeza trên cây ăn quả có múi bằng sinh học

phân tử (tại Viện Bảo vệ thực vật năm 2010 – 2012)

72

3.8 Kết quả giám định bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại

cây có múi chủ lực ở Hà Nội và Cao Phong – Hoà Bình (năm

2010)

74

3.9 Sự phân bố của một số loài vi rút và viroid trên cây ăn quả có múi

thu nhận ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (Viện Bảo vệ thực vật,

2011)

75

3.10 Cải tiến phương pháp tách chiết thô DNA trong chẩn đoán bệnh 78

v

vàng lá greening, (Phòng thí nghiệm trường Đại học tổng hợp Đài

Loan, 11/2011)

3.11 Khả năng lan truyền bệnh vàng lá greening qua hạt giống (Nhà

lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2011)

83

3.12 Khả năng lan truyền bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại

cây ăn quả có múi bằng phương pháp ghép, (Nhà lưới Viện Bảo

vệ thực vật, 2011)

85

3.13 Kết quả sự lan truyền bệnh tristeza qua mắt ghép (Nhà lưới Viện

Bảo vệ thực vật, 2011)

86

3.14 Ảnh hưởng của mật độ rầy chổng cánh đến khả năng lan truyền

bệnh vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, tháng

4/2011)

87

3.15 Ảnh hưởng của thời gian nhiễm rầy chổng cánh đến khả năng lan

truyền bệnh vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật,

2011)

88

3.16 Khả năng di chuyển của rầy chổng cánh trên các cây thí nghiệm

(Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 4/2011)

90

3.17 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Liberibacter asiaticus trên một

số chủng loại thuộc họ Rutacea (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật,

2011)

97

3.18 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ cam (Citrus sinensis) bị bệnh vàng lá

greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

100

3.19 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ quýt (Citrus reticulata) bị bệnh vàng

lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

102

v

3.20 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ bưởi (Citrus grandis) bị bệnh vàng lá

greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)

103

3.21 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ chanh (Citrus aurantifolia) và quất

(Citrus fortunella) bị bệnh vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo

vệ thực vật, 2013)

104

3.22 Kết quả đánh giá phản ứng của giống chanh Thanh Yên

với nguồn bệnh thuộc chủng I và II (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực

vật, 2013)

109

3.23 Triệu chứng cơ bản của bốn chủng vi khuẩn gây bệnh

vàng lá greening ở Việt Nam và Đài Loan

111

3.24 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến chất lượng cây cam ba lá

sử dụng làm gốc ghép lần 1 (Viện Bảo vệ thực vật, 2010)

114

3.25 Ảnh hưởng của các loại gốc ghép gieo trên môi trường MS

đến tiêu chuẩn cây gốc ghép lần 1 (Viện Bảo vệ thực vật, 2010)

115

3.26 Ảnh hưởng của các loại gốc ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép

lần một (Viện Bảo vệ thực vật, 2010 – 2011)

116

3.27 Ảnh hưởng của tuổi cây gốc ghép lần 1 đến tỷ lệ cây sống sau vi

ghép với giống cam Trưng Vương (Viện Bảo vệ thực vật, 2010)

117

3.28 Ảnh hưởng của BAP đến tỷ lệ cây sống sau vi ghép lần 1 trên

giống bưởi Phục Hòa (Viện Bảo vệ thực vật, 2010 - 2011)

118

3.29 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng được bổ sung

vào môi trường lỏng trong vi ghép đỉnh sinh trưởng cam Xã Đoài,

(Phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật, 2012)

119

3.30 Kết quả thử nghiệm các kích thước đỉnh sinh trưởng khác nhau 121