Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đê

Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực

phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có

thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm

hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất

phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất

thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme

cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và

môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có

trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và

trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa

trình phân giải này.

Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí

thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm

như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một

lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm. Nấm Trichoderma

spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác.

Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có

khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất

hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát

triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống.

Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm

Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả

nhất mà giá thành lại rẻ.

1

Khóa luận tốt nghiệp

Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành tôi đã

thực hiện khóa luận này: “Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm

Trichoderma Reesei”.

1.2. Mục tiêu của đê tài

1.2.1. Mục tiêu tổng quát

 Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei.

 Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate.

1.2.2. Mục tiêu cụ thê

 Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei.

 Xác định tỷ lệ tủa tối ưu của các tác nhân tủa: Muối ammonium, cồn, aceton.

 Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cellulase.

 Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate.

 Tinh sạch enzyme cellulase.

2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào

Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase,

nhưng chỉ có một số ít vi sinh vật là có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase với số

lượng lớn. Sau đây là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme

cellulase.

Bảng 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào

STT Tên chủng Tên phân loại

Hoạt tính

celulase (unit/ml)

Thuộc nhóm

1 B26 Bacillus subtilis 5,20

Vi khuẩn

2 B505 Bacillus subtilis 9,95

3 CFd - 7,71

4 CFh - 1,45

5 MSM 04 - 0,90

6 MSM 11 - 0,92

7 Li Bacillus lichenformis 9,76

8 A-62 Streptomyces sp 0,90 Xạ khuẩn

9 Y-519

Sarcharomyces

fibuligera

1,35

10 Y-529 Nấm men Sarcharomyces

fibuligera

2,67

11 Y-32

Sarcharomyces

capsularis

1,81

12 F273 Aspergillus niger 1,08 Nấm mốc

13 708 Tricoderma konigii 0,89 Nấm sợi

14 1’ - 1,32

-

15 V2 - 0,93

16 V3 - 1,10

17 V4 - 1,07

(-): chưa phân loại

3

Khóa luận tốt nghiệp

2.2. Giới thiệu Trichoderma reesei

2.2.1. Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma

Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được

biết là Trichodermaviride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà

phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học

khác. Tình hình thay đổi trong thế chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện

tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương.

Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma"viride" mã số QM

6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này.

Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM

6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người

đã khám phá ra loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick

với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế

phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma

reesei này và các thể đột biến trên chủng đó.

Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và

Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của

Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần

đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không

tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng

nghiên cứu cơ bản hơn là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một

phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng

trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh

giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.

Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế

giới.

4

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi vê những sợi tơ phát triển của dòng nấm

Tricoderma reesei. Trong hình, các protein trong các tế bào nấm được đánh dấu màu

đỏ trong khi chất chitin – một thành phần của các thành tế bào – được đáng dấu màu

xanh dương. (Ảnh: Mari Valkonen, VTT Finland)

2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mi

Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ

chất bã mía kết hợp với cám mì. Tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm

ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma. reesei VTT-D￾80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn.

2.2.3. Hinh thái của nấm Trichoderma reesei

Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ

khuẩn ty. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối

nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không

màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình

5

Khóa luận tốt nghiệp

elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng

xanh, lục xỉn đến lục đậm.

Hình 2.2 Hình thái Trichoderma Reesei

2.2.4. Đặc điêm

Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một

số môi trường sống khác, chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Nấm

Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số

giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, những giống này có thể được bổ sung vào

trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Nấm Trichoderma khi chúng tiếp xúc

với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Vì vậy, khi

được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt

rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và còn

hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, tuy nhiên không nhiều giống có khả năng

này.

Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh

và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất

là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công

6