Khảo sát quy trình chiết xuất và thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trên mô hình in vivo của CURCUMINOID trích từ thân rễ cây nghệ (CURCUMA LONGA L.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦACURCUMINOID

TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY NGHỆ

(CURCUMA LONGA L.)

Mã số:

Thuộc nhóm ngành khoa học: Y DƯỢC

TP.Hồ Chí Minh, Tháng 04/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦA CURCUMINOID

TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY NGHỆ

(CURCUMA LONGA L.)

Mã số:

Thuộc nhóm ngành khoa học: Y DƯỢC

Sinh viên thực hiện: LÂM THIỆN VINH Nam, Nữ: Nam

Dân tộc: Kinh

Lớp, khoa: SH09A1, Công nghệ Sinh học Năm thứ: 04/Số năm đào tạo: 04

Ngành học: Công nghệ Dược phẩm

Người hướng dẫn: ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG

ThS. LAO ĐỨC THUẬN

TP.HCM, Tháng 04/2013

i

Mục lục

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG – SƠ ĐỒ ...................................................................................iv

DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................... v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.....................................................................vii

ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................................1

Phần 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY NGHỆ..................................................................4

1.1.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................................4

1.1.2. Thành phần hoá học...............................................................................................5

1.1.3. Tác dụng dƣợc lý....................................................................................................6

1.2. SƠ LƢỢC VỀ HỢP CHẤT CURCUMINOID ........................................................7

1.2.1. Tính chất hoá lý và phân loại hợp chất................................................................7

1.2.2. Hoạt tính sinh học ..................................................................................................8

1.3. PHƢƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ.................................................11

1.3.1. Phƣơng pháp chiết bằng hệ thống Soxhlet........................................................11

1.3.2. Phƣơng pháp đun khuấy từ hồi lƣu....................................................................12

1.3.3. Phƣơng pháp chiết bằng hợp chất lƣỡng cực ...................................................12

1.3.4. Phƣơng pháp kết tinh ..........................................................................................13

1.4. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ PHẢN ỨNG VIÊM....................................................16

1.4.1. Nguyên nhân gây viêm và phân loại..................................................................16

1.4.2. Những biến đổi chủ yếu trong viêm ..................................................................17

1.4.3. Mối liên hệ giữa phản ứng viêm và cơ thể........................................................20

1.4.4. Các thuốc kháng viêm hiện nay..........................................................................20

1.5. SỬ DỤNG MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG NGHIÊN CỨU Y SINH ............20

1.5.1. Ý nghĩa của việc sử dụng mô hình động vật trong nghiên cứu y sinh ..........20

1.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng dƣợc lý thuốc chống viêm bằng

mô hình động vật .................................................................................................21

ii

Mục lục

Phần 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG THÍ NGHIỆM .......................................................24

2.1.1. Đối tƣợng thí nghiệm...........................................................................................24

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ..............................................................................25

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................28

2.2.1. Quy trình chiết xuất chung curcuminoid từ thân rễ nghệ................................28

2.2.2. Khảo sát quá trình chiết curcuminoid bằng các hệ dung môi khác nhau......29

2.2.3. Khảo sát quá trình chiết curcuminoid theo thời gian chiết bằng các phƣơng

pháp khác nhau ....................................................................................................30

2.2.4. Phân tích định tính và định lƣợng curcuminoid ...............................................31

2.2.5. Xây dựng mô hình chuột bị viêm chân .............................................................32

2.2.6. Khảo sát tác dụng kháng viêm của cucurminoid .............................................33

2.2.7. Thống kê và xử lý số liệu....................................................................................36

Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CHIẾT CURCUMINOID BẰNG CÁC LOẠI

DUNG MÔI KHÁC NHAU......................................................................................38

3.2. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CHIẾT CURCUMINOID THEO THỜI GIAN

BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP KHÁC NHAU......................................................41

3.3. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG CURCUMINOID...........................43

3.3.1. Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng................................................43

3.3.2. Định tính bằng phƣơng pháp đo điểm nóng chảy ............................................44

3.3.3. Định tính bằng phƣơng pháp phổ hồng ngoại FT-IR......................................44

3.3.4. Định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS..............47

3.4. KẾT QUẢ TẠO MÔ HÌNH CHUỘT BỊ VIÊM CHÂN.......................................48

3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA CURCUMINOID50

3.5.1. Chỉ tiêu tỷ lệ phù chân chuột..............................................................................50

3.5.2. Chỉ tiêu trọng lƣợng chuột..................................................................................53

iii

Mục lục

Phần 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................................56

4.1.1. Khảo sát quá trình chiết curcuminoid bằng các loại dung môi khác nhau ...56

4.1.2. Khảo sát quá trình chiết curcuminoid theo thời gian chiết bằng các phƣơng

pháp khác nhau ....................................................................................................56

4.1.3. Phân tích định tính curcuminoid ........................................................................56

4.1.4. Xây dựng mô hình chuột bị viêm chân .............................................................57

4.1.5. Khảo sát tác dụng kháng viêm của curcuminoid .............................................57

4.2. ĐỀ NGHỊ.....................................................................................................................57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................58

PHỤ LỤC

iv

Mục lục

DANH MỤC BẢNG – SƠ ĐỒ

PHẦN 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bảng 1.1. Khóa phân loại thực vật của nghệ và các cây chi Curcuma.............................4

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của nghệ Curcuma longa L..............................................5

Bảng 1.3. Tính chất lý hóa của curcuminoid.......................................................................7

Bảng 1.4. Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp chiết soxhlet.........................................12

Bảng 1.5. Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đun khuấy từ hồi lƣu...........................12

Bảng 1.6. Hiệu suất các chất lƣỡng cực dùng chiết xuất curcuminoid. .........................13

PHẦN 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết xuất chung curcuminoid từ thân rễ nghệ

Curcuma longa L. .............................................................................................28

Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết tối ƣu...........................................29

Sơ đồ 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát phƣơng pháp và thời gian chiết. .........................30

Sơ đồ 2.4. Quy trình khảo sát tác dụng kháng viêm của curcuminoid...........................34

PHẦN 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Bảng 3.1. Khối lƣợng tinh thể curcuminoid chiết bằng các loại dung môi khác nhau.38

Bảng 3.2. Năng suất chiết trung bình và hiệu suất của từng loại dung môi. .................38

Bảng 3.3. Khối lƣợng tinh thể curcuminoid theo thời gian chiết bằng hai

phƣơng pháp khác nhau......................................................................................41

Bảng 3.4. Năng suất trung bình và hiệu suất chiết theo thời gian của hai

phƣơng pháp chiết...............................................................................................41

Bảng 3.5. Kết quả xác định hệ dung môi chạy sắc ký bản mỏng....................................43

Bảng 3.6. Kết quả đo điểm nóng chảy................................................................................44

Bảng 3.7. Kết quả đo quang phổ hồng ngoại IR. ..............................................................44

Bảng 3.8. Kết quả sắc ký lỏng ghép khối phổ curcuminoid. ...........................................47

Bảng 3.9. Tỷ lệ phù chân chuột và hiệu suất tạo mô hình viêm......................................49

Bảng 3.10. Tỷ lệ phù chân chuột qua các ngày thí nghiệm .............................................51

Bảng 3.11. Trọng lƣợng chuột qua các ngày thí nghiệm .................................................53

v

Mục lục

DANH MỤC HÌNH

PHẦN 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1. Curcuma longa L...................................................................................................5

Hình 1.2. Curcumin.................................................................................................................8

Hình 1.3. Demethoxycurcumin .............................................................................................8

Hình 1.4. Bisdemethoxycurcumin.........................................................................................8

Hình 1.5. Hệ thống chiết Soxhlet ....................................................................................... 11

Hình 1.6. Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ tan và nhiệt độ...................................... 14

Hình 1.7. Các bƣớc kết tinh và thu tinh thể ...................................................................... 15

Hình 1.8. Hiện tƣợng viêm da chân (A) và hiện tƣợng viêm da bàn tay (B) ............... 16

Hình 1.9. Các biến đổi trong phản ứng viêm.................................................................... 19

PHẦN 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1. Nghệ tƣơi và bột nghệ Curcuma longa L. .......................................................24

Hình 2.2. Chuột bạch Mus musculus var. albino..............................................................24

Hình 2.3. Bếp khuấy từ VELP ARE và máy đo điểm nóng chảy Stuart SMP11. ........26

Hình 2.4. Curcumin chuẩn, thuốc medexa và dầu olive...................................................26

Hình 2.5. Đèn UV hiện huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC.................................27

Hình 2.6. Máy đo phổ FT- IR BRUKER EQUINOX 55. ................................................27

Hình 2.7. Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LC – MS micrOTOF – Q. ...........................27

Hình 2.8. Sát trùng vùng chân (A) và tiêm formol gây viêm (B) ...................................33

Hình 2.9. Curcuminoid hòa tan trong dầu olive ................................................................35

Hình 2.10. Lô chuột thí nghiệm............................................................................................35

Hình 2.11. Thao tác giữ chuột (a) và đƣa kim cho uống vào thực quản (b)...................35

Hình 2.12. Các vị trí đo chu vi trên bắp chân chuột .........................................................36

vi

Mục lục

PHẦN 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.1. Bản mỏng sắc ký curcuminoid chiết đƣợc.........................................................39

Hình 3.2. Tinh thể curcuminoid chiết đƣợc ........................................................................39

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng curcuminoid chiết bằng các dung môi

khác nhau..............................................................................................................40

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn lƣợng curcuminoid qua các giờ chiết của hai

phƣơng pháp chiết...............................................................................................42

Hình 3.5. Sắc ký bản mỏng định tính curcuminoid chiết đƣợc .......................................43

Hình 3.6. Phổ IR curcuminoid chiết xuất...........................................................................45

Hình 3.7. Phổ IR cucumin chuẩn ........................................................................................46

Hình 3.8. Chuột co chân (A) và chân chuột liệt tạm thời (B) sau khi gây viêm ...........48

Hình 3.9. Chân chuột trƣớc và sau khi gây viêm ..............................................................48

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ phù chân chuột sau khi gây viêm giữa các lô

thí nghiệm.............................................................................................................49

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên tỷ lệ phù chân chuột .......................................51

Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên trọng lƣợng chuột ...........................................53

vii

Mục lục

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bcl-2 B – cell lymphoma 2

c-Myc v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)

ĐC Đối chứng

HIV Human immunodecifiency virus

NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drugs

ROS Reactive oxygen spices

TGF Tranforming growth factor

TNF Tumor necrosis factors

viii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thông tin chung

- Tên đề tài: KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

TRÊN MÔ HÌNH IN VIVO CỦA CURCUMINOID

TRÍCH TỪ THÂN RỄ CÂY NGHỆ (CURCUMA LONGA L.)

Sinh viên thực hiện Lớp Khoa Năm thứ/ số năm

đào tạo

Lâm Thiện Vinh SH09A1 Công nghệ sinh học 04/04

Nguyễn Vũ Thanh Tùng SH09A1 Công nghệ sinh học 04/04

Nguyễn Thị Thanh Xuân SH09A2 Công nghệ sinh học 04/04

Mai Thị Thanh Huệ SH09A1 Công nghệ sinh học 04/04

Trần Thanh Tùng SH10A1 Công nghệ sinh học 03/04

Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG

ThS. LAO ĐỨC THUẬN

2. Mục tiêu đề tài

Khảo sát loại dung môi chiết, thời gian chiết, phƣơng pháp chiết xuất tối ƣu và

tinh sạch hợp chất curcuminoid từ thân rễ cây nghệ Curcuma longa L..

Xây dựng mô hình chuột bị viêm chân bằng formol và khảo sát nồng độ formol

gây viêm tối ƣu.

Khảo sát tác dụng kháng viêm của curcuminoid ở các liều lƣợng khác nhau.

3. Tính mới và sáng tạo

Tận dụng nguồn dƣợc liệu là cây nghệ Curcuma longa L. phong phú tại địa

phƣơng ứng dụng vào chiết xuất và thu nhận hợp chất curcuminoid có hoạt tính ở dạng

tinh sạch, phù hợp với xu thế hiện nay.

Sử dụng hợp chất curcuminoid chiết đƣợc ứng dụng vào thực tiễn với bƣớc đầu

thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trên mô hình in vivo.

ix

4. Kết quả nghiên cứu

Hiệu quả tách chiết hợp chất curcuminoid tối ƣu khi sử dụng dung môi chiết là

acetone (H% = 5,06%) với thời gian chiết phù hợp là 10 tiếng bằng phƣơng pháp đun

khuấy từ hồi lƣu.

Độ tinh sạch của curcuminoid chiết bằng các loại dung môi khác nhau là tƣơng

đƣơng nhau (curcumin chiếm khoảng 70% hỗn hợp).

Hiệu quả tạo mô hình chuột bị viêm bằng phƣơng pháp tiêm cơ đùi thành công

với tỉ lệ phù chân đạt khoảng 70% khi sử dụng liều 0,05 ml formol 8%.

Việc sử dụng curcuminoid ở liều 90 mg/kg có tác dụng kháng viêm đối với

chuột bị gây viêm bằng formol và không làm ảnh hƣởng đến các chỉ tiêu sinh lý của

chuột thí nghiệm.

5. Đóng góp về mặt kinh tế – xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc

phòng và khả năng áp dụng của đề tài

Về mặt kinh tế – xã hội, đề tài đã khảo sát và chiết xuất đƣợc hợp chất

curcuminoid từ nguồn dƣợc liệu khá kinh tế là cây nghệ Curcuma longa L. sẵn có tại

địa phƣơng. Hợp chất đƣợc tinh sạch và ứng dụng khảo sát khả năng kháng viêm trên

mô hình in vivo.

Về mặt giáo dục và đào tạo, đề tài cung cấp những kiến thức cơ bản từ các bƣớc

khảo sát quy trình chiết xuất cũng nhƣ các thí nghiệm gây viêm và khảo sát khả năng

kháng viêm để đƣa vào làm tài liệu tham khảo thực hành cho các môn Chiết xuất dược

liệu, Sinh học chức năng động vật và Công nghệ sinh học Động vật cho sinh viên

ngành Công nghệ Sinh học, Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Bên cạnh đó, đề tài

cũng góp phần giúp trau dồi kỹ năng làm việc nhóm hiệu quả, rèn luyện thêm các thao

tác thực hành phòng thí nghiệm, có đƣợc kỹ năng xử lý các vấn đề mà thí nghiệm đặt

ra.

Đề tài có khả năng ứng dụng cao, đây sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu các sản

phẩm thuốc chứa curcuminoid có nguồn gốc từ tự nhiên trong việc điều trị các bệnh về

viêm nhiễm.

6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ

tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả

nghiên cứu (nếu có)