Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn streptomyces dicklowii.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

------

Nguyễn Hoàng Minh Huy

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ

CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN

Streptomyces dicklowii.

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC:

TS. TRẦN THỊ THANH

Tp. HCM, 2006

LỜI CÁM ƠN

Trên hết, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ TRẦN THỊ

THANH, người đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời

gian làm đề tài; với tất cả tinh thần tình thương và trách nhiệm cô đã giúp tôi

hoàn thành luận văn, bên cạnh đó tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức quí báu

nơi cô cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học.

Tôi chân thành cám ơn thầy cô ở khoa sinh, khoa hóa - trường đại

học sư phạm tp HCM, thầy cô ở bộ môn sinh hóa - trường đại học khoa học tự

nhiên, đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài luận văn cũng

như thầy cô công tác tại phòng thí nghiệm vi sinh - sinh hóa, phòng thí nghiệm

sinh lý thực - trường đại học sư phạm tp HCM đã giúp đỡ, động viên và tạo

mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm đề tài.

Tp HCM, tháng 3 năm 2006

NGUYỄN HOÀNG MINH HUY

MỤC LỤC

Trang

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn:

1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái.

1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn.

1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn:

1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh.

1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về

kháng sinh.

1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng

sinh.

1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất

kháng sinh.

1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh.

1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh.

1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối.

1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc.

1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh.

1.2. Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn:

1.2.1. Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn.

1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn.

1.3. Vai trò của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phòng chống

nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng:

1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng.

1.3.2. Vai trò của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phòng

chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng.

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.

2.1. Vật liệu:

2.2. Phương pháp:

2.2.1. Phương pháp vi sinh vật.

2.2.1.1. Phương pháp làm phòng ẩm quan sát hình thái vi

thể của xạ khuẩn.

2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh –

phương pháp khuếch tán trên thạch.

2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật.

2.2.2. Phương pháp hóa sinh.

2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp

chất cao phân tử của xạ khuẩn.

2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích

3

3

3

3

6

10

10

11

13

15

16

19

21

21

22

22

22

30

31

31

40

47

52

52

52

53

53

54

54

thích sinh trưởng thực vật.

2.2.3. Phương pháp hóa lý.

2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của

chất kháng sinh.

2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh.

2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhóm chức trong cấu

trúc hóa học của chất kháng sinh.

2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng hoà tan trong các

dung môi của chất kháng sinh.

2.2.4. Phương pháp khác.

2.2.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị

nhiễm bệnh.

2.2.4.2. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng ra khỏi

đất.

2.2.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi

cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt.

2.2.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi

cấy xạ khuẩn lên sự phát triển của cây con.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.

3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn

Streptomyces dicklowii.

3.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.

3.1.2. Đặc điểm sinh trưởng phát triển trên các môi trường

nuôi cấy khác nhau.

3.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn.

3.2. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn

Streptomyces dicklowii.

3.2.1. Thử họat tính kháng sinh.

3.2.2. Lựa chọn môi trường thích hợp cho việc tạo kháng

sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii.

3.3. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất

kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii.

3.3.1. Ảnh hưởng pH ban đầu:

3.3.2. Ảnh hưởng chế độ thông khí:

3.3.3. Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu:

3.3.4. Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon:

3.3.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ:

3.4. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn

Streptomyces dicklowii.

3.4.1. Lựa chọn dung môi thích hợp.

3.4.2. Tách chiết và tinh sạch kháng sinh:

3.4.3. Tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh từ chủng xạ

khuẩn Streptomyces dicklowii.

55

57

57

57

60

61

61

61

62

62

62

63

63

64

66

72

72

73

76

76

78

80

83

85

89

89

92

95

3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces

dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng.

3.5.1. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên

nấm bệnh hại cây trồng:

3.5.2. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên

tuyến trùng hại cây trồng.

3.6. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces

dicklowii đến hoạt động sinh lý của cây trồng.

3.6.1. Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên khả năng nảy mầm của

hạt:

3.6.2. Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên sự phát triển của cây

con:

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

98

98

101

107

107

108

111

1

Ở ĐẦU

Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất rõ: làm giảm năng suất

cây trồng, giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và bảo quản, ảnh hưởng

xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng. Từ thế kỷ 18 Anton De Bary đã đặt nền

móng môn khoa học bệnh cây (1853). Để khắc phục những thiệt hại do bệnh

cây gây ra, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc

hóa học, … trong đó sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa và ngăn chặn bệnh

hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử dụng, hiệu quả cao

nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phòng bệnh cho cây đạt hiệu quả

lớn.

Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học cũng như phân

hóa học người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống rất lớn.

Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất, nước

làm cho người và gia súc bị ngộ độc. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu

chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn

lâu trong đất của các chất hoá học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo

thời gian. Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa

học đã tạo nên dư lượng lớn không cho phép trong rau màu và lương thực, gây

nên những vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết

trong thời gian qua.

Để khắc phục nhược điểm này của thuốc hóa học cũng như bảo vệ

môi sinh, người ta đã tìm kiếm các biện pháp và phát hiện vai trò của vi sinh

vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của hệ sinh thái. Bằng các biện

pháp khống chế sinh học, người ta đã từng bước sản xuất ra nhiều chế phẩm vi

sinh vật ở qui mô lớn và được sử dụng trong công tác phòng trừ sâu bệnh.

Càng ngày người ta càng sử dụng rộng rãi những chế phẩm kháng

sinh từ các chủng xạ khuẩn đối kháng, mà đặc tính của những chất kháng sinh

2

đó đã thoả mãn được những tính chất cần thiết để có thể sử dụng trong bảo vệ

thực vật, như:

- Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của

cây. Ở một số nồng độ thích hợp chúng còn kích thích khả năng nảy mầm của

hạt và sinh trưởng của cây.

- Không gây hại cho người và gia súc.

- Có hiệu lực trong một thời gian nhất định ở ngoài môi

trường tự nhiên.

- Có tác dụng tiêu diệt một cách có chọn lọc vi khuẩn gram

dương, hoặc vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh.

Dicklow.M.B cùng cộng sự vào năm 1996 đã công bố patent số

5549889 về loài Streptomyces dicklowii, loài có khả năng kháng nấm và tuyến

trùng hại cây trồng, rất thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học

trong nông nghiệp.

Chúng tôi nhận được chủng Streptomyces dicklowii từ phòng thí

nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn này

được nhập từ Mỹ. Để tiến tới sử dụng có hiệu quả chủng xạ khuẩn này trong

điều kiện môi trường Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ

CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii”

3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn:

1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái:

Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng

có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào

nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu

vô ti (Amytoz), không phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng có những

đặc điểm giống nấm mốc hơn như có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ

khuẩn hệ sợi không có vách ngăn. Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu

từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên

thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc.

Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan, 1998).

Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí

trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn

dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng

tròn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và

vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có

nếp nhăn hoặc sần sùi. Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn

lạc của xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp

trong tương đối xốp hơn, và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc của xạ

khuẩn có thể mang các màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám,

màu tím.

4

Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn

Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi

trường là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng

để cung cấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên còn gọi là khuẩn ty dinh

dưỡng. Đường kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty

không có vách ngăn và không bị đứt đoạn. Tuỳ loại môi trường mà khuẩn ty

cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan

được trong nước có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ.

Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành

nên những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng loài mà cuống

sinh bào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng có thể

mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh

5

bào tử có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 –

7nm. (xem hình 1.2)

Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn

Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường

có hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử có các dạng như: dạng nhẵn

(hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tóc.

6

Hình 1.3: Bào tử dạng gai ở Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình

chụp dưới kính hiển vi điện tử theo ijs.sgmjournals.org/.../ medium/frontcover.gif

)

Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn ở Streptomyces violazeoruber (hình chụp dưới

kính hiển vi điện tử theo www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg )

1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:

1.1.1.2.1. Đặc điểm sinh lý nuôi cấy:

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạ

khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất

7

trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm). Hầu như trong các loại đất đều có mặt

của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn

ưa nhiệt. Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính.

Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng

sử dụng có thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử

dụng bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vô cơ); protein, pepton,

cao ngô, …(nguồn nitơ hữu cơ).

1.1.1.2.2. Khả năng sinh enzym của xạ khuẩn:

Enzym là một chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào vi

sinh vật, nó đóng một vai trò quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật.

Enzym không những hoạt động xúc tác những phản ứng chuyển hóa

trong cơ thể mà còn xúc tác những chuyển hóa bên ngoài môi trường – điều

này có ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng enzym vi sinh vật vào công nghiệp,

nông nghiệp,…

Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận các loại enzym như:

- Enzym amylaza: thu nhận từ các loài Streptomyces aureofaciens,

Streptomyces diastochromogens, …

- Enzym cenllulaza: thu nhận từ các loài Streptomyces antibioticus,

Streptomyces sp. 0143, …

- Enzym proteaza: thu nhận từ Streptomyces kinoluteus,

Streptomyces verticillatus var. zynogenes, Actinomyces fradiae, …

- Enzym kitinaza: thu nhận từ Streptomyces griseus, …

Trong đó enzym proteaza của xạ khuẩn được ứng dụng nhiều trong

công nghệ thực phẩm – có tác dụng làm mềm thịt. Các chế phẩm được bán

trên thị trường như: PRONAZA của Nhật (thu nhận từ Streptomyces griseus);

M – zim của Mỹ (thu nhận từ Streptomyces fradiae) (Nguyễn Trọng Cẩn,

1998).