Khảo sát đặc điểm phân tử trên gen PCSK9 trong mối liên quan đến bệnh cao Cholesterol có tính chất gia đình ở người bệnh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

PHẠM HOÀNG NĂNG

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ TRÊN GEN PCSK9

TRONG MỐI LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH

CAO CHOLESTEROL CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH

Ở NGƯỜI BỆNH VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Phạm Hoàng Năng

Ngày sinh: 01/02/1995 Nơi sinh: thành phố Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã học viên: 1884202010013

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống

thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Khảo sát đặc điểm phân tử trên gen PCSK9 trong

mối liên quan đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình ở người bệnh Việt

Nam” là bài nghiên cứu của chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan

rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc

được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này

mà không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường đại

học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP. Hồ Chí Minh, Năm 2020

……………………………..

Phạm Hoàng Năng

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình giảng

dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cần thiết và hết lòng hướng dẫn, hỗ trợ em

trong suốt quá trình học tập chương trình cao học và thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ.

Em xin cảm ơn TS. Trương Kim Phượng và TS. Lao Đức Thuận đã hướng dẫn, hỗ

trợ, chỉ bảo em không chỉ những kiến thức chuyên môn, tinh thần nghiên cứu nghiêm

túc và làm việc hiệu quả mà còn chỉ dạy em nhiều kinh nghiệm sống trong suốt quá

trình thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ.

Em xin cảm ơn các anh chị học viên, các bạn đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em có thể

hoàn thành Luận Văn Thạc Sĩ một cách thuận lợi nhất.

Em xin cảm ơn Quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học và Quý Thầy Cô khoa Đào

Tạo Sau Đại Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo,

truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo

điều kiện cho em có cơ hội được học tập, thực hiện và hoàn thành Luận Văn Thạc Sĩ.

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cha mẹ đã nuôi

dưỡng, dạy bảo để con có được ngày hôm nay. Xin cảm ơn anh chị em trong gia đình,

bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và hoàn thành Luận Văn Thạc Sĩ.

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

iii

TÓM TẮT

Bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình (Familial hypercholesterolemia - FH) là

dạng bệnh lý rối loạn di truyền ở dạng trội, với biểu hiện đặc trưng là sự tăng cao bất

thường nồng độ cholesterol trong máu, dẫn đến sự tích tụ cholesterol ở da, gân và

trong mạch máu (Khachadurian, 1964; Goldstein, 1974). Bệnh nhân mắc FH có nguy

cơ cao mắc các bệnh về tim mạch từ rất sớm, điển hình như bệnh mạch vành có thể

xuất hiện ở độ tuổi 40 đến 50 và nếu không được điều trị sớm, ở tuổi 60, khoảng 85%

bệnh nhân sẽ bị nhồi máu cơ tim (Polychronopoulos và Tziomalos, 2019).

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), bệnh cao

cholesterol (tăng cholesterol) trong máu làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và

đột quỵ. Bệnh cao cholesterol là nguyên nhân gây ra 2,6 triệu ca tử vong. Trong năm

2008, WHO đã ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh cao cholesterol ở người trưởng thành khoảng

39% (WHO, 2008). Nguyên nhân dẫn đến bệnh cao cholesterol trong máu là hút

thuốc, béo phì, có lối sống thụ động, chế độ dinh dưỡng nghèo nàn, mất cân đối (tiêu

thụ nhiều chất béo),v.v…, và có liên quan mật thiết với các rối loạn di truyền trên các

gen liên quan đến quá trình chuyển hóa lipid trong máu như: gen Low - Density

Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB), Proprotein Convertase

Subtilisin/Kexin - 9 (PCSK9), ... (Kopin và Lowenstein, 2017; Veljkovic et al., 2018;

Mach et al., 2020).

Gen proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) mã hóa protein giữ vai trò

quan trọng trong quá trình chuyển hóa cholesterol. Một số dạng đột biến điểm xuất

hiện trên exon gen PCSK9 là nguyên nhân gây nên sự tăng chức năng của protein

PCSK9. Hệ quả dẫn đến sự rối loạn quá trình chuyển hóa cholesterol, tăng lượng

LDL-C (LDL - Cholesterol) trong máu – một dạng bệnh lý FH (Veljkovic et al.,

2018).

Hướng nghiên cứu đặc điểm phân tử liên quan đến bệnh lý rối loạn chuyển hóa

cholesterol đã và đang được triển khai ở nhiều quốc gia, tuy nhiên, vẫn chưa được

phát triển tại Việt Nam. Vì vậy, trong phạm vi luận văn thạc sỹ, nghiên cứu này được

tiến hành với mục tiêu: Xác định đặc điểm phân tử xuất hiện trên gen PCSK9 trong

iv

mối liên quan đến bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình trên người bệnh Việt

Nam.

Nghiên cứu này thực hiện các phương pháp chính: Xác định tỷ lệ và sự phân bố của

các biến thể xuất hiện trên gen PCSK9 trên thế giới thông qua phân tích tổng hợp dựa

trên mô hình phân tích ảnh hưởng cố định/ngẫu nghiên, đồng thời, xác định một số

tính chất đột biến nổi trội trên gen PCSK9 ở bệnh nhân mắc bệnh rối loạn lipid máu

tại Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự Sanger.

Kết quả nghiên cứu ghi nhận được: Từ 32 nghiên cứu khoa học liên quan đến bệnh

cao cholesterol có tính chất gia đình và tính chất đột biến trên gen PCSK9, chúng tôi

ghi nhận tỷ lệ xuất hiện biến thể trên gen PCSK9 trên người bệnh FH vào khoảng

5,67% (95%CI = 3,68 – 8,05; p < 0,0001). Trong đó, tỷ lệ của các biến thể GOF là

3,57% (95%CI = 1,76 – 5,97; p < 0,0001) và LOF là 6,05% (95%CI = 3,35 – 9,47; p

< 0,0001). Tỷ lệ các biến thể xuất hiện trên gen PCSK9 cũng cao hơn ở các bệnh nhân

tại Châu Á và Châu Phi, thấp hơn ở Bắc Mỹ, Châu Âu và Châu Đại Dương. Ngoài ra,

chúng tôi ghi nhận exon 1 và exon 2 thuộc gen PCSK9 có tỷ lệ xuất hiện các biến thể

GOF và LOF cao hơn so với các exon còn lại. Từ đó, chúng tôi xác định được exon 1

và exon 2 là các vùng mã hóa tiềm năng cho khảo sát tính chất đột biến trên gen

PCSK9. Đối với 26 mẫu DNA từ người bệnh cao cholesterol tại Việt Nam, chúng tôi

ghi nhận có sự xuất hiện của các biến thể trên gen PCSK9 ở 14 trên tổng số 26 bệnh

nhân tham gia vào nghiên cứu này.

v

ABSTRACT

Familial hypercholesterolemia is a common dominant disorder of cholesterol

metabolism characterized by elevated level of serum cholesterol and the presence of

tendon xanthomata (Khachadurian, 1964; Goldstein, 1974). Patients with FH are at

high risk of early-onset atherosclerotic cardiovascular disease. Coronary heart

disease presents during the 4th to 5

th decade of life. Without treatment at the age of 60

years, approximately 85% percent of FH patients will have suffered a myocardial

infarction (Polychronopoulos và Tziomalos, 2019).

According to the World Health Organization (WHO), raised cholesterol levels

increase the risks of heart disease and stroke. Overall, raised cholesterol is estimated

to cause 2.6 million deaths. In 2008, the global prevalence of raised total cholesterol

among adults was 39% (WHO, 2008). Raised cholesterol typically associated with

behavioral risk factors such as smoking, sedentary lifestyle, and poor dietary habits,

and it’s also strongly related to genetic burdens on genes which are take part in the

cholesterol metabolism such as Low - Density Lipoprotein Receptor (LDLR),

Apolipoprotein B (ApoB), Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin - 9 (PCSK9), ...

(Kopin và Lowenstein, 2017; Veljkovic et al., 2018; Mach et al., 2020).

The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) gene encodes for the

protein which plays an important role in the LDL metabolism. Many gain of function

mutations in PCSK9 have been reported. These mutations increases LDLR

degradation activity of the PCSK9 protein, which leads to considerably elevated

LDL-C levels and the development of FH (Veljkovic et al., 2018).

Researchs on molecular characteristics related to cholesterol metabolism disorders

has been deployed in many countries, however, has not yet been developed in

Vietnam. Therefore, this study aims to presents the molecular characteristics of

PCSK9 gene related to familial hypercholesterolemia on the Vietnamese patients.

Through meta-analysis, based on fixed/random effect model, we determined the

propotion and distribution of PCSK9 variants on FH patients all over the world. We

vi

also identified molecular characteristics of PCSK9 gene in patients with dyslipidemia

in Vietnam by Sanger sequencing method.

Total of 32 cohort studies were enrolled into current study. The analysis results

indicated that, based on the random-effect model, the weighted prevalence of PCSK9

mutation was 5.67% (95%CI = 3.68 – 8.05, p < 0.0001). The prevalence of PCSK9

GOF mutations was 3.57% (95%CI = 1.76 – 5.97, p < 0.0001) and PCSK9 LOF

mutations was 6.05% (95%CI = 3.35 – 9.47, p < 0.0001). Additionally, the first and

the second exon were identified as the hot spot of mutation occurred in PCSK9. Both

GOF and LOF mutations have a higher proportion in Asia and Africa to compare

with other regions. We also detected PCSK9 variants on 14 of 26 dyslipidemia

patients in Vietnam.

vii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ......................................................................................................i

Lời cảm ơn ..........................................................................................................ii

Tóm tắt ................................................................................................................iii

Mục lục ................................................................................................................ vii

Danh mục hình và đồ thị ................................................................................... xi

Danh mục bảng................................................................................................... xii

Danh mục từ viết tắt .......................................................................................... xiii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU............................................................................... 1

1.1.Cơ sở hình thành luận văn ..................................................................... 1

1.2.Mục tiêu nghiên cứu................................................................................ 3

1.3.Giả thuyết nghiên cứu............................................................................. 3

1.4.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.......................................................... 3

1.5.Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 5

1.6.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn................................................................ 5

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU..................................... 6

2.1. Cholesterol............................................................................................... 6

2.2. Lipoprotein.............................................................................................. 6

2.3. Chu trình chuyển hóa LDL-C ............................................................... 6

2.4. Bệnh rối loạn lipid máu (Dyslipidemia)................................................ 7

2.4.1. Định nghĩa ........................................................................................... 7

2.4.2. Nguyên nhân........................................................................................ 7

2.4.3. Dấu hiệu và triệu chứng....................................................................... 7

2.4.4. Chẩn đoán ............................................................................................ 7

2.5. Bệnh cao cholesterol mang tính chất gia đình (Famillial

Hypercholesterolemia - FH).......................................................................... 8

2.5.1. Định nghĩa ........................................................................................... 8

2.5.2. Các thể bệnh FH .................................................................................. 8

viii

2.5.3. Nguyên nhân........................................................................................ 9

2.5.4. Chẩn đoán ............................................................................................ 9

2.5.5. Bệnh FH tại Việt Nam......................................................................... 12

2.6. Proprotein Convertase Serine/Kexin 9 (PCSK9).................................... 13

2.6.1. Định vị ................................................................................................. 13

2.6.2. Cấu trúc protein PCSK9 ...................................................................... 13

2.6.3. Chức năng............................................................................................ 14

2.6.4. Tính chất đột biến trên gen PCSK9 ..................................................... 15

2.6.5. Một số công trình nghiên cứu về đột biến trên gen PCSK9 ................ 16

2.6.6. Thuốc ức chế protein PCSK9 .............................................................. 16

2.7. Một số phương pháp phát hiện đột biến trên gen PCSK9 .................. 17

2.8. Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) ...................................................... 18

2.8.1. Định nghĩa ........................................................................................... 18

2.8.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phân tích tổng hợp ....................... 19

2.8.2.1. Sai lệch hệ thống (Bias).................................................................. 19

2.8.2.2. Tính bất đồng nhất (Heterogeneity) ............................................... 19

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 21

3.1. Vật liệu..................................................................................................... 21

3.1.1. Các công cụ Tin-Sinh học ................................................................... 21

3.1.2. Các công cụ trực tuyến ........................................................................ 21

3.1.3. Mẫu bệnh phẩm ................................................................................... 21

3.2. Phương pháp ........................................................................................... 23

3.2.1. Khai thác dữ liệu.................................................................................. 23

3.2.2. Phân tích tổng hợp............................................................................... 25

3.2.3. Khảo sát in silico ................................................................................. 26

3.2.3.1. Thu thập trình tự gen PCSK9 ......................................................... 26

3.2.3.2. Khảo sát các bộ mồi nhằm phát hiện đột biến trên gen PCSK9..... 26

3.2.3.3. Phân tích chức năng đột biến ......................................................... 26

3.2.4. Thực nghiệm........................................................................................ 28

ix

3.2.4.1. Tách chiết DNA bộ gen.................................................................. 28

3.2.4.2. Đánh giá chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp đo mật độ

quang (Optical density – OD) ..................................................................... 29

3.2.4.3. Phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự mục tiêu trên gen PCSK9

..................................................................................................................... 29

3.2.4.4. Phương pháp điện di trên gel agarose ............................................ 31

3.2.4.5. Giải trình tự và phân tích trình tự sản phẩm PCR.......................... 31

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN........................................................ 33

4.1. Khai thác dữ liệu..................................................................................... 33

4.2. Phân tích tổng hợp.................................................................................. 38

4.2.1. Đặc điểm đột biến trên gen PCSK9 ....................................................... 38

4.2.2. Ảnh hưởng của yếu tố địa lý đến tính chất đột biến trên gen PCSK9 ... 42

4.2.3. Đặc điểm phân bố biến thể trên gen PCSK9 ......................................... 42

4.3. Khảo sát in silico ..................................................................................... 45

4.3.1. Thu thập trình tự gen PCSK9 .............................................................. 45

4.3.2. Một số trình tự mồi thu thập được nhằm phát hiện đột biến trên gen PCSK9

....................................................................................................................... 45

4.4. Kết quả thực nghiệm .............................................................................. 48

4.4.1. Đặc điểm bộ mẫu................................................................................. 48

4.4.2. Kết quả tách chiết DNA ...................................................................... 48

4.4.3. Kết quả thực hiện PCR-giải trình tự.................................................... 49

4.4.4. Phân tích kết quả giải trình tự sản phẩm PCR..................................... 51

4.4.4.1. Biến thể GOF.................................................................................. 58

4.4.4.2. Biến thể LOF .................................................................................. 59

4.5. Thảo luận................................................................................................. 63

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ............................................................ 68

5.1. Kết luận.................................................................................................... 68

5.1.1. Khai thác dữ liệu................................................................................ 68

5.1.2. Phân tích tổng hợp ............................................................................. 68