Giáo trình DNA tái tổ hợp part 10 pdf

Công nghệ DNA tái tổ hợp 160

sau đó cắt bằng enzyme hạn chế thích hợp và điện di kiểm tra trên agarose

gel. Sàng lọc các khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp.

Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc để phát hiện protein dung hợp được

tiến hành như sau: Nuôi cấy qua đêm ở 37oC (một lượng nhỏ) từ 5-10 khuẩn

lạc trong môi trường LB có chứa ampicillin. Sau đó, cảm ứng nuôi cấy bằng

cách bổ sung thêm isopropylthio-β-galactoside (IPTG) cho vector pUR và

tiếp tục nuôi ở 37 oC, đối với vector pEX thì chuyển nuôi cấy 37oC lên nhiệt

độ 40oC và tiếp tục nuôi cấy (có sục khí). Sau các khoảng thời gian nuôi cấy

khác nhau (1, 2, 3 và 4 giờ…), lấy 1 mL dịch nuôi cấy ly tâm nhanh để thu

tiểu thể, tái huyền phù chúng trong đệm 1 SDS, biến tính ở 100oC trong 3

phút, ly tâm 12.000 g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành điện di SDS

trên polyacrylamide gel 6%. Dùng dịch huyền phù tế bào chỉ mang một

mình vector làm đối chứng. Protein dung hợp sẽ xuất hiện như là một băng

mới dịch chuyển chậm hơn băng β-galactosidase trong đối chứng.

4. Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất kháng thể

Protein dung hợp có thể được tách chiết theo một số cách: dùng dịch

chiết urea, sắc ký ái lực aminophenylthiogalactoside, điện di SDS￾polyacrylamide gel hoặc phối hợp giữa các cách này. Phương pháp đơn giản

nhất là điện di SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel

electrophoresis), như trình trình bày ở mục 3 (nuôi cấy một lượng lớn trong

200 mL). Nhuộm gel và phát hiện băng protein mới, sau đó cắt băng này ra

khỏi gel, đông khô khoảng 2 ngày rồi nghiền thành bột mịn. Bột này sẽ được

dùng tiêm vào thỏ để sản xuất kháng thể.

II. Sản xuất các protein nguyên thể

Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E. coli bằng cách

sử dụng promoter điều hòa mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả.

Để biểu hiện gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh chỉ cần cung

cấp một promoter là đủ. Trong khi đó, để biểu hiện một gen eukaryote (hoặc

một gen prokaryote với một trình tự liên kết ribosome yếu) cần phải cung

cấp cả promoter lẫn trình tự liên kết ribosome (Hình 7.4). Các mức độ biểu

hiện có thể khác nhau từ dưới 1% cho tới hơn 30% protein hòa tan tổng số

(total soluble protein) của tế bào.