ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRONG MÔI TRƯỜNG IN VITRO

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA NÔNG HỌC

~~~~~***~~~~~

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA MỘT SỐ

GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRONG MÔI TRƯỜNG

IN VITRO

Người hướng dẫn: TS. VŨ THỊ THÚY HẰNG

TS. ĐINH TRƯỜNG SƠN

Người thực hiện : HOÀNG ĐỨC NHẬT LINH

Mã sinh viên : 621688

Lớp : K62CGCT

Bộ môn : DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

HÀ NỘI - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các

số liệu, kết quả trình bày trong báo cáo là trung thực, khách

quan, nghiêm túc và chưa từng được công bố trong bất cứ công

trình nào khác.

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm

2021

Sinh viên

Hoàng Đức Nhật Linh

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Di truyền – Chọn giống

cây trồng – Khoa Nông học và Bộ môn Công nghệ sinh học thực

2

vật - Khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho

em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Vũ

Thị Thúy Hằng, giảng viên Khoa Nông học và TS. Đinh Trường

Sơn, giảng viên khoa Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ bảo,

giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài này.

Em xin cảm ơn Kỹ sư Phạm Thị Ly đã hỗ trợ em trong thời

gian thực hiện các thí nghiệm về nuôi cấy mô.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật

chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian

thực tập; cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ trong

suốt thời gian qua.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 13 tháng 11 năm 2021

Sinh

viên thực hiện

Hoàng Đức Nhật

Linh

3

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 1-10/2021 tại Bộ môn

CNSH Thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông

Nghiệp Việt Nam nhằm xác định phương pháp khử trùng hạt,

ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, chất điều tiết sinh trưởng

đến khả năng phát sinh hình thái của các loại mẫu cấy và callus

của các giống đậu tương DT2008, ĐT35 và VNUAĐ2. Trong đó,

nghiên cứu xác định phương pháp khử trùng hạt đánh giá tỷ lệ

nhiễm và tỷ lệ nảy mầm sau 7 ngày nuôi cấy. Các nghiên cứu

ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, chất điều tiết sinh trưởng,

loại mẫu cấy đến khả năng phát sinh hình thái đánh giá các chỉ

tiêu bao gồm tỷ lệ phát sinh hình thái (callus, chồi, rễ), đặc

điểm hình thái callus (kích thước, màu sắc, cấu trúc), đặc điểm

chồi rễ phát sinh của mẫu cấy sau 6 tuần nuôi cấy. Kết quả các

thí nghiệm cho thấy khử trùng bằng Presept 5% trong 15 phút,

sau đó bóc vỏ hạt và khử trùng tiếp bằng Presept 5% trong 10

phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm rất thấp, dưới 5% và không ảnh

hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt (tỷ lệ nảy mầm đạt trên

90%). Nền môi trường, kiểu gen (giống), chất điều tiết sinh

trưởng (BA, BA + αNAA, BA + αNAA + IAA) có ảnh hưởng rõ rệt

đến khả năng tái sinh của đậu tương. Trong đó, nền môi trường

MS bổ sung vitamin là thích hợp cho sự tái sinh đậu tương từ

các nguồn mẫu cấy khác nhau. Chồi ngọn thích hợp để phát

sinh callus, đốt lá mầm thích hợp cho sự tạo chồi. Môi trường

MS bổ sung vitamin + 2 mg/l BA đối với giống ĐT35 hoặc 3 mg/l

BA đối với giống VNUAĐ2 là thích hợp cho sự phát sinh callus từ

chồi ngọn. Callus của giống ĐT35 có sự cảm ứng phát sinh chồi

ở nồng độ 1 mg/l αNAA bổ sung thêm BA nhưng tỷ lệ còn thấp

4

(2%). Bổ sung BA, αNAA, IAA có ảnh hưởng đến cấu trúc callus

nhưng không cho sự tái sinh tạo chồi từ callus đậu tương.

Từ khóa: Tái sinh, đậu tương, VNUAĐ2, ĐT35, callus, tạo

chồi

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Tran

g

2.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới từ năm 2011

– 2019 7

2.2 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam từ năm 2010 – 2020 9

2.3 Một số phương pháp nuôi cấy mô đậu tương 20

3.1 Thành phần môi trường sử dụng trong khảo sát môi

trường nuôi cấy và loại mẫu cấy đến khả năng phát

sinh hình thái

29

3.2 Thành phần môi trường trong thí nghiệm đánh giá ảnh

hưởng của nồng độ BA và loại mẫu cấy đến khả năng

phát sinh hình thái

32

5

3.3 Thành phần môi trường trong thí nghiệm đánh giá ảnh

hưởng của nồng độ BA, NAA và IAA đến khả năng phát

sinh hình thái của callus ở 2 giống đậu tương ĐT35 và

VNUAĐ2

33

4.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng hạt đến khả

năng tạo mẫu vô trùng và nảy mầm của 3 giống đậu

tương DT2008, ĐT35 và VNUAĐ2

35

4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và mẫu cấy đến

khả năng phát sinh hình thái của 3 giống đậu tương

DT2008, ĐT35 và VNUAĐ2 sau 6 tuần nuôi cấy

39

4.3 Ảnh hưởng của giống và loại mẫu cấy đến khả năng

phát sinh hình thái của 3 giống đậu tương DT2008,

ĐT35 và VNUAĐ2 sau 6 tuần nuôi cấy

40

4.4 Ảnh hưởng của môi trường và mẫu cấy đến đặc điểm

phát sinh hình thái của 3 giống đậu tương DT2008,

ĐT35 và VNUAĐ2 sau 6 tuần nuôi cấy 43

4.5 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng phát sinh

hình thái của hai giống đậu tương ĐT35 và VNUAĐ2

sau 6 tuần nuôi cấy

46

4.6 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến đặc điểm phát sinh

hình thái của giống đậu tương ĐT35 và VNUAĐ2 sau 6

tuần nuôi cấy

50

4.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA và αNAA đến khả năng phát

sinh hình thái của callus của 2 giống đậu tương ĐT35

và VNUAĐ2 sau 6 tuần nuôi cấy

54

4.8 Ảnh hưởng của nồng độ BA và αNAA đến đặc điểm phát

sinh hình thái của callus của giống ĐT35 và VNUAĐ2

sau 6 tuần nuôi cấy

55

4.9 Ảnh hưởng của nồng độ IAA và αNAA đến khả năng

phát sinh hình thái của callus của 2 giống đậu tương

ĐT35 và VNUAĐ2 sau 6 tuần nuôi cấy

58

4.10 Ảnh hưởng của nồng độ IAA và αNAA đến đặc điểm

hình thái callus của 2 giống đậu tương ĐT35 và

VNUAĐ2 sau 6 tuần nuôi cấy

60

6

DANH MỤC HÌNH

ST

T

Tên hình Tran

g

2.1 Một số vật liệu nuôi cấy trong nuôi cấy mô đậu tương 18

2.2 Môi trường và thành phần các phytohooc-môn trong

tái sinh đậu tương 24

3.1 Chuẩn bị mẫu cấy trụ hạ diệp, chồi ngọn và lá mầm 30

3.2 Đốt lá mầm được cắt từ cây con sau 7 ngày nuôi cấy

và đưa vào bình nuôi cấy 31

3.3 Callus sau 6 tuần nuôi cấy và được lựa chọn cắt nhỏ

để cấy chuyển sang môi trường tái sinh 33

4.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng hạt đến tỷ lệ

nhiễm của hạt ở 3 giống đậu tương DT2008, ĐT35,

VNUAĐ2

36

4.2 Hình thái của cây con sau khi nuôi cấy 7 ngày nuôi

cấy trong môi trường in vitro 37

4.3 Sự phát sinh hình thái của các loại mẫu cấy trên nền

môi trường GB5 + 1,5 mg/l BA sau 6 tuần nuôi cấy. 45

4.4 Sự sinh trưởng của các loại mẫu cấy trên nền môi

trường MS bổ sung vitamin + 1,5 mg/l BA sau 6 tuần

nuôi cấy.

45

4.5 Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái 52

7

từ chồi ngọn sau 6 tuần nuôi cấy của (a) ĐT35 và (b)

VNUAĐ2

4.6 Sự tái sinh tạo chồi từ callus sau 6 tuần nuôi cấy của

(a) ĐT35 và (b) VNUAĐ2 58

4.7 Hình thái callus 2 giống đậu tương (a) ĐT35 và (b)

VNUAĐ2 sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS +

vitamin bổ sung các nồng độ BA, αNAA và IAA khác

nhau.

61

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

BA (6-BA) Benzyladenine (6-Benzyladenine)

cs Cộng sự

CNSH Công nghệ sinh học

CT Công thức

2,4 D 2,4 Dichlorophenoxyaxetic acid

ĐC Đối chứng

GB5 Gamborg B5

IAA Indole-3-axetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

MS Muraghige và Skoog (1962)

MT Môi trường

NXB Nhà xuất bản

αNAA Alpha-Naphthaleneacetic acid

TB Trung bình

TN Thí nghiệm

8

Chương I. ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. Tính cấp thiết của đề tài

Đậu tương (Glycine max L. Merril) là loại đậu tốt nhất trên

toàn cầu và là cây họ đậu hạt quan trọng và lâu đời nhất, góp

phần chiếm khoảng 25% lượng dầu ăn toàn cầu và khoảng 2/3

lượng protein cô đặc trên thế giới làm thức ăn chăn nuôi. Với

khoảng 40% protein và 20% dầu, đậu tương là một cây lấy hạt

có dầu có giá trị.

Hạt đậu tương chứa hàm lượng protein cao, giàu dinh

dưỡng chính vì vậy là cây thực phẩm cho con người và gia súc.

Từ hạt đậu, ta có thể chế biến được nhiều các sản phẩm khác

nhau như: Sản xuất dầu thực vật, sản xuất dầu ăn, đậu phụ, tào

phớ, sữa đậu tương, là những sản phẩm công nghiệp được chế

biến từ đậu tương rất có lợi cho sức khoẻ con người, góp phần

chống suy dinh dưỡng và các bệnh thần kinh, tim mạch. Ngoài

việc cung cấp 40-50% lượng protein thì trong hạt đậu tương có

chứa hàm lượng lớn lipit (12 - 24%). Vì vậy, đậu tương là loài

cây công nghiệp lấy dầu quan trọng của thế giới. Bên cạnh đó,

do có khả năng cố định đạm tự do nhờ cộng sinh với vi khuẩn

Rhizobium japonicum mà đậu tương là cây trồng bảo vệ đất và

chống xói mòn. Cây đậu tương còn được FAO xem là cây trồng

chiến lược góp phần xóa đói, giảm nghèo, tạo sinh kế cho người

nông dân ở các nước thu nhập nghèo và trung bình.

Ở Việt Nam, diện tích trồng đậu tương mặc dù giảm trong

những năm gần đây nhưng đậu tương vẫn là cây trồng quan

trọng vì là nguồn cung cấp dinh dưỡng, dầu và protein thực vật

9

quan trọng cho người và vật nuôi. Tuy vậy, sản xuất đậu tương

trong nước mới chỉ cung cấp được 18% nhu cầu (Mai Quang Vinh

& cs., 2009). Do đó, nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương

luôn là một trong những mục tiêu quan trọng cải công tác chọn

tạo giống. Với sự phát triển của khoa học, đặc biệt trong lĩnh

vực công nghệ sinh học thì phương pháp chuyển gen và chỉnh

sửa gen đang là hướng đi mới, cung cấp công cụ chọn tạo giống

với ưu thế về mức độ chính xác và rút ngắn thời gian chọn tạo

vật liệu, dòng, giống mới với các tính trạng mục tiêu. Có nhiều

phương pháp chuyển gen vào thực vật, trong đó phương pháp

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

vào mô in vitro nhằm tạo cây trồng biến đổi gene đem lại tỷ lệ

thành công cao nhất. Tuy nhiên hiệu quả chuyển gen và chỉnh

sửa gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó khả năng tái sinh

in vitro có vai trò quyết định.

Đã có nhiều nghiên cứu về việc tái sinh in vitro đậu tương

thông qua các cơ quan như lá mầm, trụ hạ diệp, mắt lá thật

đầu tiên, lá thật đầu tiên của cây non, phôi soma,…với các môi

trường khác nhau (Sign & cs. 2020). Cũng như các nghiên cứu

tái sinh với các trồng khác, khả năng tái sinh ở đậu tương phụ

thuộc vào các yếu tố như kiểu gen (giống), thành phần môi

trường, loại mẫu nuôi cấy. Chính vì thế cần phải có các nghiên

cứu cơ bản về khả năng tái sinh của các nguồn vật liệu hay

giống đậu tương trước khi tiến hành các nghiên cứu về chuyển

gen hay chỉnh sửa gen đối với vật liệu nhất định. Xuất phát từ

những ly do trên, tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng tái

sinh của một số giống đậu tương trong môi trường in vitro” phục vụ

10

nghiên cứu chọn giống sử dụng công nghệ chỉnh sửa gen hoặc

chuyển gen trong tương lai.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Xác định ảnh hưởng của phương pháp khử trùng hạt đến

khả năng tạo mẫu vô trùng và khả năng nảy mầm của các

giống đậu tương

Xác định ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và loại mẫu

cấy đến khả năng phát sinh hình thái của các giống đậu tương.

Xác định ảnh hưởng của nồng độ của các chất điều tiết

sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái của callus của các

giống đậu tương.

1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của các yếu tố như khử

trùng, môi trường và vật liệu cấy đến khả năng tái sinh in vitro

ở các giống đậu tương. Kết quả của nghiên cứu góp phần cung

cấp thông tin để xây dựng quy trình tái sinh in vitro đậu tương,

phục vụ nghiên cứu chọn giống sử dụng công nghệ chỉnh sửa

gen hoặc chuyển gen trong tương lai.

11