Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô và thuốc Plenastem trên mô hình chuột tổn thương gan do tắc ống dẫn mật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN MINH THƯ

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUÂ ĐIỀU TRỊ CỦA

TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ THUỐC PLENASTEM®

TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN

DO TẮC ỐNG DẪN MẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN MINH THƯ

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUÂ ĐIỀU TRỊ CỦA

TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ THUỐC PLENASTEM®

TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN

DO TẮC ỐNG DẪN MẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS TRƯƠNG HÂI NHUNG

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : NGUYỄN MINH THƯ

Ngày sinh: 02/01/1984 Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên : 18884202010006

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư

viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố

Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin

khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Trương Hải Nhung

Học viên thực hiện: Nguyễn Minh Thư Lớp: MBIO018A

Ngày sinh: 02-01-1984 Nơi sinh: TP.HCM

Tên đề tài: Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô và thuốc Plenastem® trên

mô hình chuột tổn thương gan do tắc ống dẫn mật.

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên Nguyễn Minh Thư được bảo vệ

luận văn trước Hội đồng:

1. Về nội dung & đánh giá thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài:

Bệnh lý tổn thương gan nói chung hay hẹp đường mật nói riêng đã và đang tạo ra gánh nặng

bệnh tật ở nhiều quốc gia. Các phương pháp điều trị hiện nay chủ yếu tập trung vào điều trị

triệu chứng của bệnh, kết cục của bệnh nhân là xơ gan tiến triển và ung thư gan. Bệnh nhân

bệnh gan giai đoạn cần được ghép gan để kéo dài thời gian sống, trong khi đó nguồn mô gan

hiến tạng không đáp ứng đủ nhu cầu ghép.

Nghiên cứu tìm kiếm các phương pháp điều trị khác giúp kéo dài thời gian sống cho bệnh

nhân hẹp đường mật là rất cấp thiết. Tế bào gốc được đề xuất như giải pháp tiềm năng cho

điều trị bệnh lý thoái hoá tế bào nói chung và bệnh lý gan nói riêng. Đề tài đã hoàn thành

được các mục tiêu và nội dung đặt ra và góp phần trả lời câu hỏi nghiên cứu: “Đánh giá

hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô và thuốc Plenastem® trên mô hình chuột tổn

thương gan do tắc ống dẫn mật”

2. Về phương pháp nghiên cứu độ tin cậy của các số liệu:

Mô hình bệnh lý tắc mật trên chuột là mô hình kinh điển đã được ứng dụng nhiều nên có độ

tin cậy cao.

Các phương pháp đánh giá của nghiên cứu tiếp cận đầy đủ từ các cấp độ: tế bào (flow

cytometry, thu nhận tế bào từ gan, mô (HE, IHC) và cơ thể (sinh lý, sinh hoá).

Các số liệu ghi nhận là trung thực và có xử lý thống kê.

3. Về kết quả khoa học của luận văn

Luận văn đã đạt được các kết quả chính như sau:

- Áp dụng được quy trình phẫu thuật gây tạo chuột tổn thương gan do tắc mật

- Đánh giá được hiệu quả điều trị của USB-MSC trên mô hình chuột BDL. Kết quả nghiên

cứu chỉ ra UCB-MSC liều 5x105

tb/con hiệu quả điều trị tốt.

- Chưa thể đánh giá hiệu quả của việc kết hợp tế bào gốc trung mô từ cuống rốn người

(5x105 tb/con) với thuốc Plenastem® (184mg/kg) cùng lúc trên mô hình chuột Swiss BDL

bởi vì tỷ lệ tử vong cao khi kết hợp tế bào và Plenastem®.

4. Về kết quả thực tiễn của luận văn:

Kết quả nghiên cứu của luận văn đóng góp mới cho ứng dụng điều trị bệnh lý gan nói chung

và bệnh lý hẹp đường mật nói riêng. Liệu pháp tế bào gốc trung mô từ dây rốn có tính an

tooàn và hiệu quả trên mô hình chuột tổn thương gan do tắc mật. Từ kết quả nghiên cứu

không chỉ mở ra một tiềm năng trong ứng dụng liệu pháp tế bào gốc trung mô từ dây rốn

trong điều trị bệnh lý ống mật.

5. Ý kiến kết luận (mức độ đáp ứng yêu cầu đối với LVThS: Luận văn đáp ứng

được các yêu cầu đối với luận văn thạc sĩ và được phép bảo vệ luận văn trước hội đồng

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 04 năm 2021.

Người nhận xét

PGS.TS. Trương Hải Nhung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung

mô và thuốc Plenastem® trên mô hình chuột tổn thương gan do tắc ống dẫn

mật” là bài nghiên cứu của chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam

đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố

hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Không có nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này mà

không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các

trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP. Hồ Chí Minh, Năm 2021

Nguyễn Minh Thư

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PTN. Nghiên cứu &

Ứng dụng Tế bào gốc cùng Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) mã số 108.05-2017.30 đã hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài: “Đánh giá

hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô và thuốc Plenastem® trên mô hình chuột

tổn thương gan do tắc ống dẫn mật.”

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Trương Hải Nhung, người đã tận tình

truyền đạt cho tôi những kiến thức cần thiết và hết lòng hướng dẫn, hỗ trợ tôi trong

suốt quá trình thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến em

ThS. Lê Văn Trình và ThS. Đặng Minh Thành đã theo sát, hướng dẫn và giúp đỡ tôi

rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ. Ngoài ra tôi cũng xin chân

thành cảm ơn các em Thông, Thủy, Trân, Nhân và Ngọc, những người luôn bên cạnh,

động viên tinh thần cũng như chia sẻ với tôi rất nhiều kinh nghiệm quý báu, luôn sát

cánh, hỗ trợ tôi, mang lại nhiều niềm vui và kỉ niệm đáng nhớ.

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn cô, các anh chị em làm việc tại PTN.

Nghiên Cứu và Ứng dụng Tế bào gốc cùng toàn thể các bạn sinh viên học tập tại đây

đã chỉ dạy cho tôi rất nhiều kiến thức cũng như hỗ trợ về vật chất và tinh thần, cho

tôi những trải nghiệm quý báu cũng như giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin

cảm ơn Quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học và Quý Thầy Cô khoa Đào Tạo

Sau Đại Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, truyền

đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian học tập tại đây. Tôi xin

cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện

cho tôi có cơ hội được học tập và hoàn thành trình độ đào tạo Thạc Sĩ.

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 04 năm 2021

Nguyễn Minh Thư

a

TÓM TẮT

Tắc mật bẩm sinh hay thủng đường mật ở những trẻ sơ sinh (BA) nếu không

được phát hiện sớm, không điều trị sẽ dẫn đến suy gan, xơ gan (Bates, Bucuvalas,

Alonso, & Ryckman, 1998). Thống kê cho thấy tỉ lệ mắc bệnh ở các nước Châu Á

cao hơn so với châu Âu và châu Mỹ, chẳng hạn như tỉ lệ mắc bệnh ở Mỹ là 1:19.000,

ở Anh và các nước châu Âu 1:16.000, trong khi đó tỉ lệ mắc bệnh ở các nước châu Á

như Nhật Bản và Trung Quốc khoảng 1:9.600, đặc biệt khá cao ở Việt Nam với tỉ lệ

1:2400 (M. B. Liu et al., 2017). Phương pháp phẫu thuật Kasai được phát triển bởi

bác sĩ người Nhật Morio Kasai giúp giảm bớt sự tắc mật bằng cách phẫu thuật nối

hỗng tràng với nhánh nhỏ mật trong gan (portoentersstomy). Các trường hợp bệnh

nhân không được tiến hành phẫu thuật thì sẽ tử vong trong vòng 2 năm, với thời gian

sống trung bình là 8 tháng (Bates et al., 1998). Tỷ lệ bệnh nhân sống sót sau 5 năm

không cấy ghép gan khoảng 32%-63% (Shinkai et al., 2009). Và tỷ lệ này không cải

thiện trong vòng 45 năm qua, ngay cả ở các nước phát triển. Theo WHO, Đông Nam

Á, trong đó có Việt Nam, có tỷ lệ gánh nặng bệnh tật lớn nhất so với các khu vực

khác trên thế giới trong đó có bệnh BA (M. B. Liu et al., 2017). Một số phương pháp

được áp dụng sau phẫu thuật Kasai như sử dụng kháng sinh, thuốc vận mật

(choleretics), steroid nhằm giúp cải thiện tình trạng bệnh cho dù có chứa nhiều tác

dụng phụ.

Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác động của tế bào gốc trung mô và tế bào gốc

trung mô kết hợp với thuốc Plenastem® đối với tổn thương gan do tắc ống dẫn mật

trên mô hình chuột. Chuột Swiss được tiến hành phẫu thuật thắt ống dẫn mật (BDL)

để gây bệnh xơ gan. Sau BDL 7 ngày, chuột được chia làm 4 nhóm, nhóm tiêm giả

dược PBS (BDL-PBS), nhóm tiêm thuốc Plenasterm® với liều 184.5mg/kg trên chuột

(BDL-PLENA) (tương đương 15mg/kg trên người), nhóm tiêm tế bào gốc trung mô

được phân lập từ mô dây rốn (umbilical cord blood-derived - UCB-MSC) với liều

5x105

tb/con (BDL-MSC) và nhóm tiêm kết hợp thuốc Plenasterm® và UCB-MSC

với cùng liều lượng (BDL-PLENA/MSC). Hiệu quả điều trị được đánh giá thông qua

b

tỉ lệ sống chết, các chỉ số sinh hóa (AST, ALT, Albumin) và thay đổi cấu trúc mô học

(nhuộm H&E), sự tích lũy collagen trong mô gan (nhuộm Sirius Red), sự hoạt hóa tế

bào hình sao (nhuộm hóa mô miễn dịch với marker α-SMA) và sự tăng sinh ống mật

trong gan (nhuộm IHC với marker là Ck7).

Kết quả: Sau 12 ngày điều trị, so với nhóm đối chứng (Normal), chuột tiêm

MSC (5x105

tb/con) có tỉ lệ sống cao (100%), giảm tổn thương gan (chỉ số sinh hóa

men gan Alb, AST và ALT trung bình lần lượt là 2.42±0.14Dg/L, 355.53±102.82

UI/L và 329.95±112.98 UI/L,), giảm diện tích xơ gan thông qua diện tích hoại tử

trung bình là 5.06±2.85%, sự tích lũy collagen trong gan trung bình là 1.81±0.76%

và tỷ lệ dương tính của protein α-SMA là 1.06±0.39% và số lượng ống mật tăng sinh

(Ck7) là 20.71±3.66 ống mật/mm2

. Trong khi đó hai nhóm BDL-PBS và BDL￾PLENA chuột có tỷ lệ sống thấp (lần lượt là 62.5% và 61.53%); chỉ số men gan cao

(AST lần lượt đạt 498.77±69.18 UI/L và 344.58±133.59UI/L, ALT đạt

500.85±136.72 UI/L và 366.40±116.88 UI/L) và giảm khả năng sản xuất Alb ở gan

(Alb ở BDL-PBS và BDL-PLENA lần lượt là 2.14±0.07 Dg/L và 2.08±0.13 Dg/L);

diện tích hoại tử cao (8.73±4.86% và 21.49±10.98%), sự tích lũy collagen cũng nhiều

(2.83±1.53% và 2.55±0.84%), tỷ lệ dương tính protein α-SMA là 3.15±0.83%,

2.88±0.82% và số lượng ống mật tăng sinh là 9.20±1.22 ống mật/mm2

và 17.03±4.82

ống mật/mm2

. Riêng nhóm BDL-PLENA/MSC có tỷ lệ sống thấp (14.29% tương

đương 1/8 con sống) nên không an toàn và không đủ cỡ mẫu, do đó trong nghiên cứu

này chúng tôi không đánh giá hiệu quả điều trị của nhóm.

Kết luận: Bước đầu đánh giá được tính an toàn và hiệu quả điều trị của chuột

tổn thương gan do tắc ống dẫn mật khi điều trị bằng tế bào gốc trung mô phân lập từ

dây rốn (UCB-MSC) là an toàn và có hiệu quả trên chuột BDL. Sử dụng thuốc

Plenastem® với liều lượng 15mg/kg trên người = 184.5mg/kg đơn lẻ hay kết hợp

UCB-MSC liều 5x105

tb/con không thích hợp ở chuột Swiss trên mô hình BDL.

c

ABSTRACT

Congenital obstruction or perforation of the Biliary atresia (BA) in newborn

infants, if not detected early, and untreated can lead to liver failure and cirrhosis

(Bates, Bucuvalas, Alonso, & Ryckman, 1998). Statistics show that the incidence rate

in Asia is higher than that in Europe and America, such as 1: 19,000 in the US, 1:

16,000 in the UK and European countries, while That is, the prevalence rate in Asian

countries such as Japan and China is about 1: 9,600, especially quite high in Vietnam

at the rate of 1: 2400 (MB Liu et al., 2017). Kasai surgery method developed by

Japanese doctor Morio Kasai helps to reduce the obstruction by surgically connecting

the jejunum with the small bile branch in the liver (portoentersstomy). If not treated

early, can lead to die within 2 years, with an average survival time of 8 months (Bates

et al., 1998). The proportion of patients who survive 5 years without liver

transplantation is about 32% -63% (Shinkai et al., 2009). And this rate has not

improved over the past 45 years, even in developed countries. According to WHO,

Southeast Asia, including Vietnam, has the largest rate of disease burden compared

to other regions in the world including BA disease (M. B. Liu et al., 2017). Some

methods are applied after Kasai surgery such as antibiotics, choleretics, steroids to

help improve the condition even though they contain many side effects.

This study aimed to evaluate the effects of mesenchymal stem cells and

mesenchymal stem cells in combination with the drug Plenastem® on liver damage

caused by bile duct obstruction in a mouse model. Swiss mice underwent bile duct

surgery (BDL) for cirrhosis. After 7 days of BDL, 4 groups, including injected

placebo PBS (BDL-PBS), injected the drug Plenasterm® (BDL-PLENA) with a dose

of 184.5 mg/kg in mice (equivalent to 15mg/kg in human), injected mesenchymal

stem cells isolated from umbilical cord blood-derived (UCB-MSC) at a dose of 5x105

cell/mice (BDL-MSC) and a groub of injection of Plenasterm® and UCB-MSC was

the same dose (BDL-PLENA/MSC). Treatment efficacy was assessed by mortality,

biochemical indicators (AST, ALT, Albumin) and histological changes (H&E

d

staining), collagen accumulation in liver tissue (Sirius Red staining), astrocytes

activation (immunohistochemical staining with α-SMA marker) and hepatic tubular

proliferation (IHC staining with marker Ck7).

Results: After 12 days of treatment, compared to the control group (Normal),

mice injected with MSC had a high survival rate (100%), reduced liver damage

(average liver enzymes of liver enzymes, Alb, AST and ALT. 2.42 ± 0.14Dg / L,

355.53 ± 102.82 UI / L and 329.95 ± 112.98 UI / L respectively,), reduction of area

of cirrhosis through mean area of necrosis of 5.06 ± 2.85%, collagen accumulation in

liver the mean was 1.81 ± 0.76% and the positive rate of α-SMA protein was 1.06 ±

0.39% and the number of bile ducts (Ck7) was 20.71±3.66 bile ducts/mm2

.

Meanwhile, the two groups BDL-PBS and BDL-PLENA mice have low survival rates

(62.5% and 61.53% respectively); High liver enzyme index (AST reached 498.77 ±

69.18 UI/L and 344.58 ± 133.59UI/L, respectively, ALT 500.85 ± 136.72 UI/L and

366.40 ± 116.88 UI/L) and decreased liver production of Alb (Alb in BDL-PBS and

BDL-PLENA are 2.14 ± 0.07 Dg/L and 2.08 ± 0.13 Dg/L, respectively); area of

necrosis is high (8.73 ± 4.86% and 21.49 ± 10.98%). Also, collagen accumulation is

high (2.83 ± 1.53% and 2.55 ± 0.84%), α-SMA protein positive rate is 3.15 ± 0.83%,

2.88 ± 0.82% and the number of bile duct proliferation was 9.20±1.22 bile duct/mm2

and 17.03±4.82 bile duct/mm2

. Particularly, the BDL-PLENA/MSC group has a low

survival rate (14.29%) which is not safe, so in this study we do not evaluate the

treatment effectiveness of the group.

Conclusion: Initially assessing the safety and therapeutic efficacy of mice with

liver damage caused by bile duct obstruction during umbilical cord mesenchymal

stem cell treatment (UCB-MSC) is safe and effective. The effectiveness of

Plenastem® at a dose of 15mg/kg in human = 184.5mg/kg in mice alone or in

combination with UCB-MSC at a dose of 5x105

cell /mice is not suitable in Swiss

mice on the BDL model.