Xây dựng lý thuyết và thực nghiệm nhằm định danh một số loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn trùng bằng sinh học phân tử kết hợp sinh - tin học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

X D NG L THU ẾT VÀ TH C NGHI M

NH M Đ NH DANH M T SỐ LOÀI NẤM THU C CHI

NẤM K SINH C N TR NG B NG SINH HỌC PH N

T KẾT H P SINH – TIN HỌC

Thuộc nhóm ngành khoa học: Vi sinh – Sinh học phân tử

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2014.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

X D NG L THU ẾT VÀ TH C NGHI M

NH M Đ NH DANH M T SỐ LOÀI NẤM THU C CHI

NẤM K SINH C N TR NG B NG SINH HỌC PH N

T KẾT H P SINH – TIN HỌC

Thuộc nhóm ngành khoa học: Vi sinh – Sinh học phân tử

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hải Ngọc Nam, Nữ: Nữ

Tr ng Thị ch Vân Nam, Nữ: Nữ

Hu nh Thảo Trân Nam, Nữ: Nữ

Ph m Xuân Xinh Nam, Nữ: Nữ

Trịnh Hoàng Luân Nam, Nữ: Nam

Dân tộc: Kinh

Lớp, khoa: Công Nghệ Sinh Học Năm thứ: 4 /Số năm đào t o:4

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên h ớng dẫn: ThS. Lao Đức Thuận

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2014.

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, chúng tôi xin gửi lời cám n chân thành nhất đến những ng ời

thầy, những ng ời b n đã luôn ở bên, truyền cho chúng tôi niềm đam mê nghiên cứu

khoa học và cho những lời khuyên bổ ích để nhóm nghiên cứu có thể vững b ớc h n

trên con đ ờng mà mình đang b ớc đi.

Chúng tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy và

ThS. Lao Đức Thuận đã tận tình h ớng dẫn, giúp đỡ, truyền đ t kinh nghiệm và kiến

thức quý báu trong suốt thời gian phụ việc t i phòng thí nghiệm Sinh học phân tử để

hoàn thành đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học.

Cảm n các b n trong nhóm đề tài và tất cả các b n phụ việc trong phòng thí

nghiệm Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên chúng tôi trong những lúc

khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài.

Chúng tôi xin gửi lời cám n đến các bậc sinh thành đã có công sinh thành và

d ỡng dục, luôn t o mọi điều kiện tốt nhất trong quá trình chúng tôi thực hiện đề tài.

ình D ng, ngày 07 tháng 04 năm 2014

Danh mục bảng biểu

Bảng 2. 1. ảng các m i sử dụng trong thực nghiệm .................................................31

Bảng 2. 2. Các thông số thiết lập cho chu k nhiệt trong phản ứng PCR để khuếch đ i

các v ng gen nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1, Rpb2, Tub, Atp6 trong thực nghiệm nh sau:

..................................................................................................................................33

Bảng 3 1 .Thông tin về trình tự và các thông số đánh giá c a các m i nh m khuếch đ i

các v ng gen mục tiêu đ ợc trình bày d ới đây: ........................................................38

Bảng 3 2. Kết quả kiểm tra DNA b ng mật độ quang phổ kế các mẫu nấm tách chiết có

bổ sung β-mercaptoethanol. .......................................................................................49

Bảng 3 3. Kết quả tổng hợp thiết lập chu k nhiệt PCR khuếch đ i các v ng gen

nrSSU, nrLSU, Rpb1, Rpb2, Tef1, Tub, Atp6 c a các mẫu nấm ký sinh côn tr ng. .....54

Bảng 3 4: Kết quả so sánh trình tự nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1 đã hiệu ch nh với các

trình tự trên Gen ank ................................................................................................61

Bảng 3. 5: NGU N G C CÁC TR NH T DN Đ C S D NG L M TH M

CHI U TRONG Đ T I T N KHO H C, NG N H NG GI NG, M S TRUY

C P TR N GEN NK ..........................................................................................62

Bảng 3.6: Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm t dữ liệu phân tử.....................77

Danh mục hình ảnh

Hình 1. 1: Cordyceps sinensis ngu n:http: medicinalmushroominfo.com ................5

Hình 1. 2: Cấu trúc hóa học c a cordycepin.................................................................7

Hình 1. 3: Cấu trúc gen và vị trí m i NS1 NS4 khuyếch đ i v ng gen nrSSU ............13

Hình 1. 4: S đ vị trí các v ng domain thuộc trình tự LSU. ......................................14

Hình 1. 5: Chức năng c a v ng CTD thuộc gen Rpb1................................................15

Hình 1. 6: Cấu trúc và c p m i khuyếch đ i gen Rpb2 ...............................................15

Hình 1. 7: cấu trúc và c p m i khuyếch đ i gen Tef1 .................................................16

Hình 1. 8: Cấu trúc gen và m i khuyếch đ i gen Tub .................................................17

Hình 3. 1. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank.........................................40

Hình 3. 2. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi NS1 và trình tự gen nrSSU ...............40

Hình 3. 3. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc NS4 và trình tự gen nrSSU.............40

Hình 3. 4. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank.........................................41

Hình 3. 5. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi LR05 và trình tự gen nrLSU ..............41

Hình 3. 6. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc LR5 và trình tự gen nrLSU .............41

Hình 3. 7. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank.........................................42

Hình 3. 8. Kết quả sắp gióng cột c a m i xuôi 983F và trình tự gen Tef1...................42

Hình 3. 9. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc 2218R và trình tự gen Tef1 ............42

Hình 3. 10.Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank ........................................43

Hình 3. 11. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi CRP 1 và trình tự gen Rpb1 ...........43

Hình 3. 12. Kết quả sắp giống cột c a m i ng ợc RP 1Cr và trình tự gen Rpb1 .......43

Hình 3. 13. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank .......................................44

Hình 3. 14. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi fRPB2-5F và trình tự gen Rpb2 .......44

Hình 3. 15. Kết quả sắp giống cột c a m i ng ợc fRPB2-7cR và trình tự gen Rpb2 .45

Hình 3. 16. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank .......................................45

Hình 3. 17. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi T12 và trình tự gen Tub ...................45

Hình 3. 18. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc T22 và trình tự genTub ...............45

Hình 3. 19. Kết quả kiểm tra m i b ng last trên Gen ank .......................................46

Hình 3. 20. Kết quả sắp giống cột c a m i xuôi TP6-c1 và trình tự genAtp6 ........46

Hình 3. 21. Kết quả sắp gióng cột c a m i ng ợc ATP6- c2 và trình tự genAtp6 ...46

Hình 3. 22. Kết quả điện di sản phẩm hai c p m i NS1 NS4, LR0R LR5 tách chiết

theo ph ng pháp phenol: chloroform. ......................................................................48

Hình 3. 23. Kết quả điện di sản phẩm hai c p m i NS1 NS4, LR0R LR5 tách chiết

theo ph ng pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol. ...........................48

Hình 3. 24. Kết quả điện di sản phẩm hai c p m i NS1/NS4, LR0R/LR5 bổ sung β￾mercaptoethanol, và tối u hóa nhiệt độ.....................................................................50

Hình 3. 25. Kết quả điện di c a sản phẩm PCR t c p m i 983F/2218R,

Crpb1/Rpb1Cr ...........................................................................................................51

Hình 3. 26. Kết quả điện di sản phẩm PCR hai m i 983F/2218R, Crpb1/Rpb1Cr ở các

nhiệt độ khác nhau.....................................................................................................51

Hình 3. 27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai c p m i fRpb2-5F/fRpb2-7cR và

T12/T22 .......................................................................................................................52

Hình 3. 28. Kết quả điện di sản phẩm PCR với c p m i ATP6-c1A/ATP6-c2A khuếch

đ i v ng gen atp6.......................................................................................................53

Hình 3. 29. Kết quả điện di sản phẩm PCR c a hai mẫu DL0015, DL0075 với bốn c p

m i nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1đã tối u hóa quy trình...............................................56

Hình 3. 30. Hiệu ch nh tín hiệu nhiễu ở đầu m ch xuôi c a LSU ...............................57

Hình 3. 31. Vị trí sai lệch c a hai kết quả giải trình tự ở đầu m ch xuôi c a LSU.......57

Hình 3. 32. Hiệu ch nh ở v ng giữa trên 2 m ch LSU ................................................58

Hình 3. 33. Hiệu ch nh v ng 3, v ng 4 trên m ch xuôi LSU.......................................59

Hình 3. 34. Hiệu ch nh v ng cuối mach xuôi LSU .....................................................59

Hình 3. 35. Hiệu ch nh v ng cuối trên m ch xuôi c a LSU ........................................59

Hình 3. 36. Hình kết quả last trình tự LSU m ch xuôi đã hiệu ch nh........................60

Hình 3. 37. Kiểm tra mức độ t ng đ ng b ng công cụ Dot plot ...............................60

Danh mục những chữ viết tắt

ATP : Adenosine triphosphate

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base-pair

DNA : deoxyribonucleotide triphosphate

ETS : external transcribed spacer

IGS : intergenic spacer

ITS : internal transcribed spacer

LSU : large subunit

ML : maximum likelihood

MP : maximum parsimony

NJ : neighbor-joining

nu : nucleotide

rDNA : ribosomal DNA

RNA : ribosomal RNA

rRNA : ribosomal RNA

SSU : small subunit

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................3

1. N M K SINH C N TR NG .........................................................................4

1.1. Đ c điểm chung và thành phần loài .............................................................4

1.2. Tiềm năng ứng dụng....................................................................................6

2. NGHI N C U Đ NH D NH V PHÁT SINH LO I......................................9

2.1. Đ c điểm nhận d ng và định danh ...............................................................9

2.2. Định danh phân tử.....................................................................................10

2.3. Nhóm gen giữ nhà house-keeping gene trong định danh phân tử các loài

nấm ..................................................................................................................11

3. T NH H NH NGHI N C U TRONG N C.................................................17

4. PH H PH N T .........................................................................................18

4.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài..........................................18

4.2. Những b ớc c bản trong nghiên cứu phát sinh ch ng loài........................18

5. K THU T PCR V GI I TR NH T T Đ NG .......................................23

5.1. K thuật PCR ............................................................................................23

5.2. Giải trình tự tự động..................................................................................24

CHƯƠNG 2: V T LI U – PHƯƠNG PHÁP .......................................................25

1. TH I GI N V Đ ĐI M NGHI N C U ..................................................26

2. V T LI U V PH NG PHÁP NGHI N C U...........................................26

2.1. ộ mẫu nấm ký sinh côn tr ng ..................................................................26

2.2. Dung cụ – thiết bị – hóa chất.....................................................................26

2.3. Danh mục các phần mềm sử dụng .............................................................28

3. TI N TR NH NGHI N C U..........................................................................28

3.1. Thu thập mẫu ............................................................................................29

3.2. Tách chiết DN tổng số t hệ sợi nấm ký sinh côn tr ng ..........................29

3.3. PCR...........................................................................................................31

3.4. Xác định trình tự đã khuyếch đ i ...............................................................34

3.5. Hiệu ch nh trình tự ....................................................................................34

3.6. So sánh với c sở dữ liệu Genbank............................................................35

3.7. Xây dựng bộ c sở dữ liệu DN ...............................................................35

3.8. Dò tìm mô hình tiến hóa ............................................................................35

3.9. Xây dựng cây phát sinh loài ......................................................................35

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N ..........................................................37

1. K T QU ĐÁNH GIÁ M I...........................................................................38

1.1. Đánh giá m i trên IDT ..............................................................................38

1.2. Kết quả kiểm tra m i b ng BLAST c a 7 gen............................................40

2. X Y D NG QUY TR NH TH C NGHI M NH M KHU CH Đ I V NG

GEN nrSSU, nrLSU, Rpb1, Tef1, RPb2, Tub, Atp6 CHO CÁC M U N M K

SINH C N TR NG...............................................................................................47

3. K T QU HI U CH NH TR NH T .............................................................56

4. K T QU SO SÁNH V I C S D LI U GEN NK..............................61

5. X Y D NG D LI U TR NH T nrSSU, nrLSU, Rpb1, Rpb2, Tef1, Tub,

Atp6........................................................................................................................62

6. K T QU X Y D NG C Y PHÁT SINH LO I .........................................66

CHƯƠNG 4. KẾT LU N VÀ ĐỀ NGH ...............................................................79

TÀI LI U THAM KHẢO .......................................................................................81

PHỤ LỤC.................................................................................................................84

Đề tài SVNCKH cấp trường năm học 2013-2014

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, nhiều loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn tr ng đã

đ ợc rất nhiều nhà khoa học ở khắp n i quan tâm nghiên cứu. Đây là chi nấm quý

hiếm có nhiều ứng dụng trong nhiều l nh vực nh y d ợc, kiểm soát sinh học. Ngay t

năm 1878, nhà vi khuẩn học ng ời nh Miles Joseph erkeley đã công bố về nấm ký

sinh côn tr ng Cordyceps sinensis đông tr ng h thảo . Đây là một lo i nấm d ợc liệu

quý hiếm, đ ợc đánh giá cao và có ảnh h ởng sâu rộng đối với nền y học Trung Quốc

trong nhiều thế k . Cordyceps sinensis có ho t tính chống phát triển tế bào khối u,

chống oxi hóa và kích thích sự đáp ứng miễn dịch c a c thể, nhờ đó chữa trị đ ợc

nhiều bệnh liên quan đến thận, huyết áp, tim m ch, miễn dịch, nội tiết tố, ung th …

Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy không ch có Cordyceps sinensis mà nhiều loài

khác trong chi Cordyceps và các chi họ hàng Isaria, Metarcordyceps cũng mang l i

những tiềm năng ứng dụng cao trong y d ợc.

Tr ớc đây, việc định danh và xây dựng hệ thống phân lo i học các loài nấm này

ch yếu dựa trên phân tích hình thái giải phẫu. Tuy nhiên, công tác định danh nấm dựa

vào hình thái đến nay vẫn ch a xây dựng đ ợc một hệ thống phân lo i chính xác cho

các loài thuộc chi nấm này. Trong thực tế, việc định danh nấm b ng hình thái g p

nhiều khó khăn là do nấm ký sinh côn tr ng là chi nấm lớn có thành phần loài vô c ng

phong phú và có khả năng biến đổi cao theo điều kiện môi tr ờng. M t khác, chúng

luôn t n t i d ng l ỡng danh: thể vô tính anamorph và thể hữu tính teleomorph .

ởi vậy, để giải quyết những khó khăn này, rất nhiều nhà nghiên cứu đã cố gắng tìm

kiếm một ph ng pháp mới giúp định danh chính xác loài và xây dựng hệ thống phát

sinh ch ng lo i c a nhóm nấm này. Hiện nay, nghiên cứu định danh phân tử kết hợp

với Tin – Sinh học là xu h ớng mới, giúp giải quyết các vấn đề mà định danh hình thái

vẫn ch a làm r .

Trong nghiên cứu này chúng tôi h ớng tới xây dựng lý thuyết và thực nghiệm

nh m định danh một số loài nấm thuộc chi nấm ký sinh côn tr ng b ng ph ng pháp

sinh học phân tử kết hợp sinh tin học. ớc đầu, chúng tôi tiến hành khảo sát in-silico:

thu đ ợc c sở dữ liệu cục bộ c a 7 v ng gen mục tiêu nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1,