Xác định kiểu cách cư trú và gen độc lực của Staphylococcus aureus ở nhóm người làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LÊ KHÁNH TRÂM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Hà Nội - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

LÊ KHÁNH TRÂM

Chuyên ngành: Vi sinh y học

Mã số: 62720115

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

PGS. TS. ĐINH HỮU DUNG

PGS. TS. NGUYỄN VŨ TRUNG

Hà Nội - 2013

Lời cám ơn

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các

thày cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Hữu

Dung, PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung, những người thày đã trực tiếp hướng dẫn và

tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Phủng, Trưởng Bộ môn Vi sinh

Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS. Nguyễn Thị Vinh, TS. Phạm Hồng Nhung,

TS. Lê Văn Duyệt, ThS. Văn Đình Tráng hướng dẫn và đóng góp cho tôi những ý

kiến quý báu trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn

CN. Nguyễn Thị Minh Thư, CN. Vũ Thị Hồ Vân, KTV. Lê Thị Hải, KTV. Phạm Thị

Vinh, những người đã giúp đỡ tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, các

thày cô giáo Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Hà Nội đã trang bị kiến thức, tạo

điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong thời gian học tập tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng

biết ơn tới Ban Giám đốc Bệnh viện Bạch Mai, Ban Lãnh đạo và tập thể Khoa Vi

sinh Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện và động viên tôi học tập tốt.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và Tập thể khoa xét nghiệm Bệnh

viện Nhiệt đới Trung ương, Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội, Trung tâm Y tế

Quận Đống Đa, các nhân viên của các cơ sở dịch vụ ăn uống tham gia nghiên

cứu, đã giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu, thu thập số liệu phục vụ luận án này.

Tôi vô cùng biết ơn những người thân trong gia đình và bạn bè thân thiết

đã động viên, hỗ trợ tôi cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập,

nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 8 năm 2013

Lê Khánh Trâm

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu do

tôi chủ trì thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh

Hữu Dung và PGS.TS Nguyễn Vũ Trung. Các số liệu

trong luận án là trung thực và kết quả nghiên cứu chưa

từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Lê Khánh Trâm

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Mục lục

Chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................3

1.1. VI HỆ Ở NGƢỜI BÌNH THƢỜNG............................................................3

1.1.1. Khái niệm về vi hệ ............................................................................ 3

1.1.2. Các vi hệ ở ngƣời.............................................................................. 3

1.1.3. Vai trò của vi hệ với sức khỏe .......................................................... 4

1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA S. AUREUS.....................................................................5

1.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại.......................................................... 5

1.2.2. Tính chất sinh học của S. aureus...................................................... 6

1.2.3. Đặc điểm di truyền của S. aureus..................................................... 7

1.3. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS...............7

1.3.1. Tỷ lệ mang ........................................................................................ 7

1.3.2. Đặc điểm và kiểu cách cƣ trú............................................................ 8

1.4. CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS ..........................................11

1.4.1. Các yếu tố độc lực là thành phần cấu trúc tế bào ........................... 11

1.4.2. Các yếu tố độc lực là sản phẩm ngoại tiết ...................................... 12

1.4.3. Các yếu tố độc lực khác.................................................................. 15

1.5. CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS.................................................16

1.5.1. Gen mã hoá coagulase của S. aureus.............................................. 17

1.5.2. Các gen mã hoá cho độc tố ruột của S. aureus............................... 19

1.6. CÁC BỆNH DO S. AUREUS GÂY RA....................................................21

1.6.1. Nhiễm khuẩn ngoài da và các mô mềm.......................................... 21

1.6.2. Hội chứng da phồng rộp ................................................................. 21

1.6.3. Viêm tủy xƣơng .............................................................................. 21

1.6.4. Viêm khớp....................................................................................... 22

1.6.5. Viêm nội tâm mạc........................................................................... 22

1.6.6. Nhiễm khuẩn huyết......................................................................... 22

1.6.7. Viêm phổi........................................................................................ 22

1.6.8. Ngộ độc thực phẩm và viêm ruột cấp............................................. 23

1.6.9. Hội chứng sốc nhiễm độc ............................................................... 24

1.6.10. Nhiễm trùng bệnh viện do S. aureus ............................................ 24

1.7. CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH S. AUREUS TRONG PHÒNG XÉT

NGHIỆM.......................................................................................................24

1.7.1 Các kỹ thuật thông thƣờng xác định S. aureus................................ 24

1.7.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử......................................................... 26

1.8. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ VÀ GEN ĐỘC LỰC

CỦA S. AUREUS .........................................................................................32

1.8.1. Các nghiên cứu trên thế giới........................................................... 32

1.8.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam............................................................ 35

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU......................................................................38

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU....................................................................38

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú

của S. aureus................................................................................... 38

2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu sự phân bố gen độc lực của S. aureus ........ 38

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................38

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 38

2.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu .............................................................. 38

2.2.3. Phƣơng pháp thu thập số liệu.......................................................... 40

2.3. VẬT LIỆU....................................................................................................40

2.3.1. Thiết bị............................................................................................ 40

2.3.2. Hóa chất .......................................................................................... 41

2.4. CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU............................................................42

2.4.1. Lấy mẫu .......................................................................................... 42

2.4.2. Phân lập, xác định S. aureus........................................................... 43

2.4.3. Lƣu giữ các chủng .......................................................................... 46

2.4.4. Quy trình PCR xác định gen độc lực .............................................. 46

2.4.5. Kỹ thuật sequencing xác nhận kết quả của phản ứng PCR ............ 53

2.5. CÁCH KHỐNG CHẾ SAI SỐ...................................................................55

2.6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ KIỂU CÁCH MANG S. AUREUS...........56

2.7. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .........................................56

2.8. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ..........................56

2.9. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU........................................................................57

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...............................................58

3.1. TỶ LỆ MANG, KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS...................58

3.1.1. Một số đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu.................................... 58

3.1.2. Tỷ lệ mang S. aureus và một số yếu tố liên quan........................... 60

3.1.3. Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi và một số

yếu tố liên quan ............................................................................. 66

3.1.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay và một số yếu tố liên quan................. 69

3.1.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay ................................................. 72

3.1.6. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay ............................................. 73

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS... 74

3.2.1. Kết quả nghiên cứu gen mã hóa coagulase của S. aureus.............. 75

3.2.2. Kết quả nghiên cứu gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus............. 79

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................85

4.1. TỶ LỆ MANG VÀ KIỂU CÁCH CƢ TRÚ CỦA S. AUREUS.............85

4.1.1. Một số đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu.................................... 85

4.1.2. Tỷ lệ mang S. aureus chung và một số yếu tố liên quan ................ 86

4.1.3. Tỷ lệ mang, kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi và một số yếu tố

liên quan......................................................................................... 90

4.1.4. Tỷ lệ mang S. aureus ở tay và một số yếu tố liên quan.................. 96

4.1.5. Tỷ lệ mang S. aureus ở cả mũi và cả tay ...................................... 100

4.1.6. Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay ........................................... 101

4.2. CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA S. AUREUS.............................................. 102

4.2.1. Gen mã hóa coagulase .................................................................. 103

4.2.2. Gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus.......................................... 107

KẾT LUẬN............................................................................................ 115

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN....................................... 116

ĐỀ XUẤT……………............................................................................ 117

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA NGHIÊN CỨU SINH

ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CHỮ VIẾT TẮT

A: Adenine

bp: Base pair (cặp bazơ)

C: Cytosine

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxyribonucleotid triphosphate

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

(Phản ứng miễn dịch gắn enzyme)

EFT: Exfoliatin toxin

G Guanine

MLST: Multi-locus sequence typing

(Giải trình tự gen nhiều locus)

MRSA: Methicillin resistant Staphylococcus aureus

(Tụ cầu vàng kháng methicillin)

PCR: Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng trùng hợp chuỗi)

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

(Kỹ thuật xác định tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)

SE: Staphyloccocal enterotoxin

(Độc tố ruột của tụ cầu)

T: Thymine

TNF: Tumor necrosis factor

(Yếu tố hoại tử u)

TSST: Toxic shock syndrome toxin

(Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc điểm các các loại dung huyết tố của S. aureus ................14

Bảng 1.2: Vị trí di truyền của một số gen sinh độc tố ruột của S. aureus .....20

Bảng 2.1: Trình tự các mồi của các gen se .............................................51

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi

SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SIE, SEJ ...................................52

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng cho các cặp mồi SEG....52

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng đối với ống chuẩn................................53

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng đối với các ống chứa mẫu....................54

Bảng 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sequence ..........................55

Bảng 2.7: Tiêu chuẩn xác định kiểu cách cƣ trú của S. aureus ...............56

Bảng 3.1: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới .................................58

Bảng 3.2: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo nhóm tuổi .......................58

Bảng 3.3: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo vị trí làm việc .................59

Bảng 3.4: Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo thâm niên công tác..........59

Bảng 3.5. Phân bố các chủng S. aureus theo các lần và vị trí lấy

mẫu ở 53 nhân viên có mẫu dƣơng tính..................................60

Bảng 3.6: Phân bố tỷ lệ mang S. aureus theo số lần lấy mẫu ..................62

Bảng 3.7: Phân bố tỷ lệ mang S. aureus ở các lần lấy mẫu .....................62

Bảng 3.8: Tỷ lệ mang S. aureus theo giới...............................................63

Bảng 3.9: Tỷ lệ mang S. aureus theo nhóm tuổi .....................................64

Bảng 3.10: Tỷ lệ mang S. aureus theo vị trí làm việc ...............................64

Bảng 3.11: Tỷ lệ mang S. aureus theo thâm niên công tác .......................65

Bảng 3.12: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo

nhóm tuổi...............................................................................67

Bảng 3.13: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo thâm

niên công tác .........................................................................69

Bảng 3.14: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay.....................................................69

Bảng 3.15: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo giới ......................................70

Bảng 3.16: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo nhóm tuổi ............................70

Bảng 3.17: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo vị trí làm việc .....................71

Bảng 3.18: Tỷ lệ mang S. aureus ở tay theo thâm niên công tác...............72

Bảng 3.19: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi và tay .........................................72

Bảng 3.20: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay tính chung ....................73

Bảng 3.21: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo nhóm tuổi .............73

Bảng 3.22: Tỷ lệ mang S. aureus ở mũi hoặc tay theo vị trí làm việc .......74

Bảng 3.23: Phân bố các genotype của gen mã hóa coagulase ở 101

chủng S. aureus......................................................................75

Bảng 3.24: Phân bố các genotype gen mã hóa coagulase của S. aureus

ở tay và mũi ...........................................................................78

Bảng 3.25: Phân bố nhân viên theo số lƣợng các genotype gen mã hóa

coagulase ...............................................................................79

Bảng 3.26: Tỷ lệ chung mang gen mã hóa độc tố ruột của S. aureus........79

Bảng 3.27: Phân bố các chủng S. aureus mang gen độc tố ruột ở mũi

và ở tay ..................................................................................81

Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu tỷ lệ mang S. aureus ở tay nhân viên

cơ sở dịch vụ ăn uống của một số tác giả ...............................98

Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu genotype gen mã hóa coagulase của

một số tác giả ....................................................................... 104

Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu gen độc tố ruột ở S. aureus của một

số tác giả .............................................................................. 111

Bảng 4.4: Sự phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lƣợng các

gen mã hóa độc tố ruột của một số nghiên cứu. .................... 113

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ mang S. aureus .........................................................63

Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi.................66

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo

giới ....................................................................................66

Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ mang và kiểu cách cƣ trú S. aureus ở mũi theo vị

trí làm việc.........................................................................68

Biểu đồ 3.5: Phân bố các genotype chính của gen mã hóa coagulase

của S. aureus......................................................................76

Biểu đồ 3.6: Phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo loại gen mã

hóa độc tố ruột...................................................................80

Biểu đồ 3.7: Phân bố tỷ lệ các chủng S. aureus theo số lƣợng các

gen mã hóa độc tố ruột.......................................................83

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh Staphylococcus aureus dƣới kính hiển vi điện tử ......6

Hình 1.2: Tỷ lệ mang S. aureus ở các vị trí khác nhau trên quần thể

ngƣời bình thƣờng và trên nhóm ngƣời mang S. aureus ở mũi ...10

Hình 1.3: Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus.......................13

Hình 1.4: Cấu trúc của gen mã hoá coagulase và vị trí của nó trên

nhiễm sắc thể .........................................................................18

Hình 1.5: So sánh vị trí cắt của AluI giữa chủng S. aureus A và

chủng S. aureus B, vị trí gắn của các primer 1, 2, 3, 4,

trong phản ứng PCR...............................................................19

Hình 1.6: Vị trí nhiễm trùng và các bệnh do S. aureus gây ra ................23

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập, xác định S. aureus.........................................43

Hình 2.2: Kết quả giải trình tự gen sec...................................................54

Hình 3.1: Kết quả điện di các sản phẩm thu đƣợc sau PCR vòng 2

xác định gen coagulase...........................................................76

Hình 3.2: Kết quả cắt DNA của một số chủng S. aureus bằng

enzyme AluI...........................................................................77

Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen seb của một số chủng

S. aureus ................................................................................81

Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen sei của một số chủng

S. aureus ................................................................................82

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen seg của một số chủng

S. aureus ................................................................................82

Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen sec của một số chủng

S. aureus ................................................................................83

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Staphylococcus aureus là một trong những vi khuẩn hay gặp nhất trên

cơ thể ngƣời, nó cũng là căn nguyên của nhiều loại nhiễm trùng khác nhau.

S. aureus có thể gây nhiễm trùng ngoài da, ngộ độc thực phẩm, viêm tủy

xƣơng, nhiễm khuẩn huyết…Tùy vào mức độ và loại nhiễm trùng mà biểu

hiện trên lâm sàng khác nhau.

S. aureus là thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời. Khoảng 30% ngƣời

khoẻ mạnh mang S. aureus. S. aureus đƣợc phát hiện thấy ở nhiều vùng của

cơ thể nhƣ da ở vùng cổ, ngực, bụng, bàn tay…và một số hốc tự nhiên trên

cơ thể. Vị trí cƣ trú hay gặp nhất của S. aureus là lỗ mũi trƣớc. S. aureus có

thể cƣ trú thƣờng xuyên, không thƣờng xuyên và không cƣ trú trên cơ thể

ngƣời. Khi có tổn thƣơng da, niêm mạc, sức đề kháng của cơ thể suy giảm

thì các nhiễm trùng do S. aureus dễ dàng xuất hiện. Sự có mặt và số lƣợng S.

aureus ở trên cơ thể phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh, miễn dịch, và nhiều

yếu tố khác của cơ thể vật chủ cũng nhƣ của vi khuẩn [6].

Phần lớn các chủng S. aureus đều có một hoặc một số gen độc lực

liên quan đến những tình trạng nhiễm trùng và bệnh lý khác nhau. Một số

gen chịu trách nhiệm sản xuất các độc tố ruột (Staphylococcal enterotoxins￾SE), gen liên quan đến hội chứng sốc nhiễm độc (Toxic shock syndrome

toxin 1-tsst1), gen mã hóa coagulase gây đông huyết tƣơng ... Ngoài ra,

nhiều gen khác chịu trách nhiệm việc S. aureus kháng lại nhiều kháng sinh

và một số kiểu gen của S. aureus cũng liên quan đến những bệnh cảnh lâm

sàng đặc thù do vi khuẩn này gây ra [57]. Trên thế giới, ngày càng có nhiều

nghiên cứu dịch tễ học phân tử của S. aureus và mối liên quan giữa các yếu

tố độc lực, các kiểu gen cũng nhƣ vai trò của các yếu tố này với tình trạng

nhiễm trùng và kháng kháng sinh của của S. aureus [9].

2

S. aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực

phẩm trên toàn thế giới và cho đến nay vẫn còn là vấn đề nan giải. Ngộ độc

thực phẩm do S. aureus chiếm khoảng 25% số vụ và 10% số bệnh nhân ngộ

độc phải nhập viện điều trị, có trƣờng hợp nặng nguy hiểm đến tính mạng. Ở

Việt Nam, S. aureus là nguyên nhân chính gây ô nhiễm thực phẩm. Do khí

hậu nóng ẩm, thiếu các điều kiện bảo quản phù hợp, sự có mặt của S. aureus

với số lƣợng lớn trong thực phẩm là nguy cơ tiềm ẩn bùng phát các vụ ngộ

độc tập thể gây tổn thất nặng về kinh tế. Những ngƣời làm việc chế biến thực

phẩm, bán hàng ăn, tiếp xúc trực tiếp với thức ăn luôn là nguồn gây ô nhiễm

S. aureus trong quá trình chế biến, sản xuất, đóng gói, vận chuyển và bảo

quản thực phẩm [15]. Ở nƣớc ta đã có nhiều nghiên cứu về vai trò gây bệnh

và tính kháng thuốc của S. aureus nhƣng chƣa có nghiên cứu về kiểu cách cƣ

trú và rất ít nghiên cứu về gen độc lực của vi khuẩn này.

Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài „„Xác định kiểu cách cƣ

trú và gen độc lực của Staphylococcus aureus ở nhóm ngƣời làm việc tại

một số cơ sở dịch vụ ăn uống” với hai mục tiêu sau:

1. Xác định tỷ lệ mang, kiểu cách cư trú của S. aureus ở mũi và tay của

nhóm người làm việc tại một số cơ sở dịch vụ ăn uống tại Hà Nội.

2. Xác định sự phân bố, tính đa hình của gen mã hóa coagulase và gen

mã hóa độc tố ruột của các chủng S. aureus phân lập được.