Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các chủng virus vacxin viêm gan vịt ở việt nam và so

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

--------------
--------------

NGUYỄN LUẬN

XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ GEN VP1

CỦA CÁC CHỦNG VIRUS VACXIN VIÊM GAN VỊT Ở

VIỆT NAM VÀ SO SÁNH VỚI MỘT SỐ CHỦNG KHÁC

CỦA THẾ GIỚI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : THÚ Y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS LÊ THANH HÒA

HÀ NỘI - 2008

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu nêu

trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chưa từng

ñược công bố hay bảo vệ trong một học vị nào.

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận

văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn

ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Hà nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008

Tác giả luận văn

Nguyễn Luận

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii

Lời Cảm Ơn

Sau thời gian học tập và nghiên cứu, ñến nay tôi ñã hoàn thành khoá học.

Nhân dịp này, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất ñến

PGS.TS. Lê Thanh Hòa - Trưởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học

(Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), người thầy ñã tận tình hướng dẫn trực

tiếp và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi ñược học tập, thực hành thí nghiệm và

giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S ðoàn Thị Thanh Hương, Th.S Nguyễn Thị

Bích Nga cùng toàn thể cán bộ Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học -

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện ñề tài nghiên cứu.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn ñến sâu sắc tới toàn thể các thầy giáo - cô giáo

trong Nhà trường, khoa Sau ñại học, Khoa Chăn nuôi - Thú y, ñặc biệt là các thầy giáo

- cô giáo ở Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, Khoa Chăn nuôi - Thú y,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời

gian học tập và hoàn thành ñề tài.

Xin chân thành cảm ơn Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học -

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã hỗ trợ kinh phí cho ñề tài nghiên cứu

này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các cơ quan, những người thân, gia ñình

và bạn bè ñã ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008

Nguyễn Luận

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam ñoan ........................................................................................................ ..1

Lời cảm ơn............................................................................................................ ..2

Mục lục................................................................................................................. ..3

Danh mục các chữ viết tắt..................................................................................... ..6

Danh mục bảng..................................................................................................... ..7

Danh mục hình........................................................................................................8

1. MỞ ðẦU.......................................................................................................... 10

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài……………………………………………………..10

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài……………………………………………...11

1.3 Ý nghĩa khoa học của ñề tài…………………………………………………11

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 12

2.1 Bệnh viêm gan virus ở vịt (Duck Hepatitis)………………………………...12

2.1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh………………………………………..12

2.1.2 Loài mắc bệnh…………………………………………………………..13

2.1.3 ðường xâm nhập và cách lây lan……………………………………….13

2.1.4 Cơ chế gây bệnh của virus……………………………………………...14

2.1.5 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích……………………………………..14

2.1.6 Chẩn ñoán bệnh viêm gan vịt do virus………………………………….16

2.1.7 Phòng chống bệnh………………………………………………………17

2.2 Một số ñặc tính sinh học của virus viêm gan vịt type I……………………..18

2.2.1 ðặc tính nuôi cấy virus…………………………………………………18

2.2.2 Sức ñề kháng của DHV-1………………………………………………20

2.2.3 ðặc tính kháng nguyên của virus DHV-1………………………………20

2.2.4 Biến dị của virus ………………………………………………………..21

2.3 Sinh học phân tử và sơ ñồ phả hệ virus viêm gan vịt type I ………………..21

2.3.1 Sơ lược về Picornavirus ………………..………………………………21

2.3.2 Sơ lược về hình thái và cấu tạo virus viêm gan vịt type I………………23

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv

2.3.3 Sơ lược về phả hệ virus DHV-1………...………………………………25

2.4 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt ……………………….………………..29

2.4.1 Miễn dịch thụ ñộng …………………….………………………………29

2.4.2 Miễn dịch chủ ñộng ……………………….……………………………30

2.5 Các kĩ thuật sinh học phân tử …………………………………………….....31

2.5.1 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) .…………………………31

2.5.2 Phản ứng RT-PCR...……………………….……………………………32

2.5.3 Kĩ thuật ñiện di…... ……………………….……………………………32

2.5.4 Nguyên lí tách dòng và lưu giữ nguồn gen………………..……………33

2.5.5 Tầm quan trọng của việc thu nhận, lưu giữ và nghiên cứu ñặc tính phân

tử gen kháng nguyên VP1 của virus vacxin viêm gan vịt ñược sử dụng ở Việt

Nam ……………………………….…………….……………………………34

2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt trong và ngoài nước...…………35

3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............... 38

3.1 Nội dung nghiên cứu……………………………………… ………………..38

3.2 Nguyên liệu….. ……………………………………………………………..38

3.2.1 Giống virus và chuỗi gen VP1….………….…………………………...38

3.2.2 Cặp mồi …………..……………………….……………………………39

3.2.3 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm……….……………………………39

3.3 Qui trình thu nhận và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt……..41

3.4 ðịa ñiểm thực hiện ñề tài ………………………………… ………………..42

3.5 Phương pháp nghiên cứu ………………………………… ………………..42

3.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số …….……………………………42

3.5.2 Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR một bước.…………………43

3.5.3 Phát hiện sản phẩm RT-PCR ……………..……………………………44

3.5.4 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR…..………….……………………………45

3.5.5 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen …………………………45

3.5.6 Thực hiện phản ứng giải trình trình tự…….……………………………49

3.5.7 Tinh sạch sản phẩm giải trình trình tự ...….……………………………50

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v

3.5.8 Xử lý số liệu……………………………….……………………………51

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................... 52

4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số………………………….. ………………..52

4.2 Kết quả phản ứng RT-PCR ………………………………..………………..53

4.3 Kết quả dòng hóa và tách dòng sản phẩm………………… ………………..54

4.3.1 Kết quả dòng hóa sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli .………………54

4.3.2 Kết quả kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp ..……………………………56

4.4 Kết quả giải trình trình tự nucleotit và axit amin của gen kháng nguyên VP1 ở

2 chủng virus vacxin viêm gan vịt…………………………….. ……………….57

4.5 Kết quả truy cập ngân hàng gen, so sánh chuỗi gen kháng nguyên VP1 của 2

chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng khác trên thế giới…..………..59

4.6 So sánh thành phần nucleotit và axit amin của gen VP1 giữa hai chủng virus

vacxin ở Việt Nam và một số chủng trên thế giới……………..………………..62

4.6.1 Các chủng tham gia trong phân tích so sánh ..…………………………62

4.6.2 Kết quả ñối chiếu so sánh thành phần nucleotit và axit amin vùng gen

VP1 của VxAC và VxXT với các chủng khác trên thế giới …………………63

4.7 Tỷ lệ tương ñồng nucleotit và axit amin giữa các chủng nghiên cứu ..……..69

4.8 Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng virus nghiên cứu

(VxAC và VxXT) với một số chủng khác……………………. ………………..71

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................... 74

5.1 Kết luận ……………………………………………………………………..74

5.2 Kiến nghị…………………………………………………...………………..74

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 75

PHỤ LỤC............................................................................................................. 81

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DPV : Duck Picornavirus

DHV : Duck Hepatitis Virus

VxXT : Vacxin do Xí nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất

VxAC : Vacxin có nguồn gốc ñưa về từ Ai Cập

DNA : Axit Deoxyribonucleic

RNA : Axit Ribonucleic

VP : Viral Protein

VPg : Viral Protein genome-linked

PCR :Polymerase Chain Reaction

RT-PCR : Revese Transcription - Polymerase Chain Reaction

EDTA : Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid

dNTP :Deoxy Nucleotide Triphosphate

ddNTP : Dideoxy Nucleotide Triphosphate

X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside

Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase

TAE : Tris Acetic acid EDTA

LB : Luria Bertani-agar

UTR : Untranslated Region

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

cs :cộng sự

tr : trang

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii

DANH MỤC BẢNG

Số bảng Tên bảng Trang

3.1 Các ñoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR 39

4.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi gen

VP1 của chủng virus vacxin Ai Cập (VxAC)

60

4.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi gen

VP1 của chủng virus vacxin xưởng thuốc (VxXT)

61

4.3 Các chủng virus viêm gan vịt sử dụng so sánh 62

4.4 So sánh tỷ lệ (%) tương ñồng về nucleotit (trên ñường chéo)

và axit amin (dưới ñường chéo) của hai chủng virus vacxin

viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng

trên thế giới thuộc DHV-1.

70