Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại một số loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia của Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

DƢƠNG VĂN TĂNG

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP

PHẦN VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ

THUỘC CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Đề tài :

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN

VÀO VIỆC PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI GỖ QUÝ THUỘC

CHI DALBERGIA CỦA VIỆT NAM

Học viên: Dƣơng Văn Tăng

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS. TS. Đinh Thị Phòng

Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

Việ

Lời cảm ơn

Trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Phòng,

Phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

đã tận tình, hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên

Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện

nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của cơ sở đào tạo sau

Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi

trong suốt khóa học.

Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn những chia sẻ, hỗ trợ nhiệt tình và các ý kiến đóng

góp của TS. Nguyễn Minh Tâm, Ths. Trần Thị Việt Thanh và CN. Vũ Thị Thu Hiền

cùng toàn thể cán bộ phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng

Thiên nhiên Việt Nam.

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Quốc

Bình, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu và sự hỗ trợ kỹ

thuật của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học trong

việc xác định trình tự DNA.

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã

luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này.

Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010

Học viên

Dƣơng Văn Tăng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực

và chƣa đƣợc sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2010

Học viên

Dƣơng Văn Tăng

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1

Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3

1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài gỗ quý hiếm thuộc chi trắc (Dalbergia)............3

1.1.1. Vị trí phân loại .......................................................................................................3

1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn một số loài gỗ quý..................4

1.1.2.1. Dalbergia assamica Benth..................................................................................5

1.1.2.2. Dalbergia cochinchinensis Pierre .......................................................................6

1.1.2.3. Dalbergia oliveri Gamble ex Prain.....................................................................7

1.1.2.4. Dalbergia tonkinensis Prain................................................................................7

1.1.2.5. Dalbergia nigrescens Kurz ................................................................................8

1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật...................................................9

1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)......................................9

1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh............................................................................10

1.2.3. Phƣơng pháp hoá học...........................................................................................10

1.2.4. Phƣơng pháp phân loại học phân tử.....................................................................11

1.3. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật .............................13

1.3.1. Cấu trúc hệ gene lục lạp.......................................................................................13

1.3.2. Vùng ITS nhân .....................................................................................................15

1.4. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử..........................................16

Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................20

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................20

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................................23

2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA và làm sạch DNA tổng số....................................23

2.2.2. Thiết kế cặp mồi...................................................................................................23

2.2.3. Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR..........................................................23

2.2.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................................24

2.2.5. Giải trình tự DNA ................................................................................................24

2.2.6. Phân tích số liệu ...................................................................................................24

Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................25

3.1. Kết quả tách chiết DNA..........................................................................................25

3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp ............26

3.2.1. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi ITS1/ITS4.....................................26

3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi psbA - trnH...................................27

3.2.3. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi matK - matK.................................28

3.2.4. Kết quả nhân bản trình tự DNA với cặp mồi trnL - trnL ....................................29

3.3. Kết quả giải mã trình tự 4 gen nghiên cứu..............................................................30

3.3.1. Kết quả xác định trình tự gen ITS nhân ...............................................................30

3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH ................................................................33

3.3.3. Kết quả giải mã trình tự gen matK.......................................................................35

3.3.4. Kết quả giải mã trình tự gen trnL.........................................................................38

3.4. Kết quả thống kê đặc điểm DNA của bộ số liệu trình tự giữa 5 loài......................40

3.4.1. Các vị trí nucleotide mang thông tin tiến hoá (parsimony) .................................40

3.4.2. So sánh sự biến đổi nucleotide giữa 4 vùng gen nghiên cứu của 5 loài gỗ quý

thuộc chi Dalbergia ........................................................................................................43

3.4.3. Khoảng cách di truyền giữa 5 loài nghiên cứu ....................................................44

3.4.4. Cây phát sinh chủng loại......................................................................................48

3.5. Xác định nguồn gốc loài .........................................................................................50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................57

Kết luận ..........................................................................................................................57

Kiến nghị........................................................................................................................58

PHỤ LỤC.......................................................................................................................67

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Đa hình chiều dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length

Polymorphism)

Barcode Mã vạch

bp Cặp bazơ (base pair)

BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

CITES Công ƣớc về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp

(Convention on International Trade in Endangered Species)

cpDNA Axít Deoxyribonucleotide lục lạp (Choloroplast Deoxyribo Nucleotide Acid)

cpSSR Các trình tự lặp lại đơn giản của lục lạp (Chloroplast Simple Sequence

Repeat)

DNA Axít Deoxyribonucleotide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EN Nguy cấp (Endangered)

Genbank Ngân hàng gen quốc tế

ISSR Các trình tự lặp lại bên trong (Inter-Simple Sequence Repeat)

ITS Internal Transcribed Spacer

IUCN Hiệp hội bảo vệ thiên nhiên quốc tế (International Union for

Conservation of Nature)

MEGA Phần mềm phân tích di truyền tiến hoá phân tử (Molecular Evolutionary

Genetics Analysis)

NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (Nationa Center for

Biotechnology Information)

NJ Neighbor Joining

NTS Khoảng trống không đƣợc sao chép (Non Transcribed Spacer)

OD Mật độ quan học (Optical Density)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

psbA Gen mã hóa protein D1, enzyme tham gia quang hóa II

RAPD Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified

Polymorphic DNA)

RNA Axít Ribonucleotide

RFLP Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length

Polymorphism)

SSR Các đoạn lặp lại (Simple Sequence Repeat)

tRNA RNA vận chuyển (transfer- RNA)

trnF RNA vận chuyển Phenylalanine

trnH RNA vận chuyển Histidine

trnL RNA vận chuyển Leucine

trnT RNA vận chuyển Threonine

UV Ánh sáng tử ngoại (Ultraviolet)

VQG Vƣờn quốc gia