Ứng dụng phương pháp pcr (polymerase chain reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHẠM THỊ HỮU KIỀU

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE

CHAIN REACTION) VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ĐỂ

KHẢO SÁT SỰ NHIỄM VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2007

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và chân thành, em xin cảm ơn:

Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm TP. HCM đã cung

cấp cho em những kiến thức quý báu trong cả khóa học, dặc biệt là TS. Trần

Thanh Thủy và TS. Trần Thị Thanh đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn, động viên em

trong suốt quá trình học tập.

Em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Trần Linh Thước đã luôn tận

tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn này.

Xin cảm ơn các bạn Nhân, Linh, Vân, Dung, Na, Ánh và tất cả các thành

viên của Lab A, đặc biệt là Ths. Nguyễn Thị Bạch Huệ, đang công tác tại Phòng

Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh học Phân tử, Trung tâm Khoa học và Công nghệ

Sinh họcTrường ĐHKHTN, ĐHQG TP. HCM, đã hết lòng giúp đỡ tôi trong

suốt thời gian thực nghiệm.

Xin cảm ơn các bạn lớp cao học K.15 - VSV và các thành viên Cao học

khóa 15 đã cùng gắn bó với tôi.

Cảm ơn Anh! Người đã luôn sát cánh và ở cạnh tôi.

Lời cảm ơn cuối cùng, con xin gởi đến tất cả “Ba Mẹ” và đại gia đình thân

yêu của con đã luôn yêu thương, đùm bọc con, là điểm tựa vững chắc và niềm

tin của con trong suốt cuộc đời.

TP. HCM, nam 2007

Phạm Thị Hữu Kiều

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AC : Relative Accuracy (Độ chính xác tương đối)

AOAC : Association of Official Analytical Chemists

ATP : Adenosine triphosphat

bp : base pair (cặp base)

BPW : Buffer Pepton Water (đệm pepton)

cAMP : cyclic Adenosine Monophosphate

cGMP : cyclic Guanosine Monophosphate

DNA : Deoxyribose nucleic acid

dNTP : deoxynucleotide triphosphate

EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

ELISA : Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay

(Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme)

FN : False Negative (âm tính giả)

NC : nuôi cấy

FP : False Positive (dương tính giả)

HUS : Haemolytic-Uraemic Syndrome (hội chứng tan huyết)

LDC : Lysine Decarboxylase

MMC : Microbiological Methods Committee

MR : Methyl Red

MYP : Mannitol - Egg York - Polymycin

NordVal : Nordic System for Validation of Alternative

PCR : Polymerase Chain Reaction

SE : Relative Sensitivity (Độ nhạy tương đối)

SP : Relative Specificity (Độ đặc hiệu tương đối)

TAE : Tris-Acetate-EDTA

TE : Tris-Acetate-EDTA

TSB : Tryptone Soya Broth

TSI : Triple Sugar Iron Agar

VP : Voges - Proskauer

WHO : World Health Organization

XLD : Xylose Lysine Desoxycholate

ISO : International Standards Organization

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

DANH MUÏC CAÙC BAÛNG

Bảng 1.1. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn ...........8

Bảng 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và năm 2006

........................................................................................................9

Bảng 1.3. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và

năm 2006 .....................................................................................10

Bảng 1.4. Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ

năm 2001 đến 2006.......................................................................11

Bảng 1.5. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát ..............14

Bảng 1.6. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm thực phẩm chế biến từ sữa

......................................................................................................14

Bảng 1.7. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm sữa chua..........................15

Bảng 1.8. Tiêu của Bộ Y tế đối với nhóm kem, nước đá.............................15

Bảng 1.9. Bảng phân loại độc tố của C. perfringens ....................................22

Bảng 2.1. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm sữa.............44

Bảng 2.2. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với các loại

nước giải khát ..............................................................................44

Bảng 2.3. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm kem ...........44

Bảng 2.4. Kích thước vạch khuếch đại của các vi khuẩn nghiên cứu ..........49

Bảng 2.5. Trình tự các mồi được sử dụng trong phản ứng PCR...................50

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm sữa tại TP.

HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ..................................63

Bảng 3.2. Thống kê kết quả kiểm tra trên mẫu sữa tại TP. HCM bằng phương

pháp PCR và nuôi cấy ................................................................66

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại

TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ...........................68

Bảng 3.4. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm nước giải khát tại

TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ...........................70

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem

tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy .....................72

Bảng 3.6. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm kem tại TP. HCM

theo phương pháp PCR và nuôi cấy ............................................73

Bảng 3.7. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp

nuôi cấy đối với chỉ tiêu Salmonella, E. coli và S. aureus...........77

Bảng 3.8. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương

pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu B. cereus và C. perfringens77

DANH MUÏC CAÙC HÌNH

Trang

Hình 2.1. Thang DNA 100bp ...........................................................37

Hình 2.2. Các bước của phản ứng PCR ..................................................... 38

Hình 2.3. Số bản sao DNA tăng theo từng chu kỳ trong phản ứng PCR .. .39

Hình 2.4. Đưa mẫu vào máy PCR ............................................................. 48

Hình 3.1. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Salmonella ............................ 58

Hình 3.2. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định E. coli.................................... 58

Hình 3.3. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định S. aureus............................... 59

Hình 3.4. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus............................... 59

Hình 3.5. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens....................... 59

Hình 3.6. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus

và C. perfringens bằng kỹ thuật PCR......................................... 59

Hình 3.7. Khuẩn lạc B. cereus ................................................................... 60

Hình 3.8. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus............................... 60

Hình 3.9. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens ...................... 60

Hình 3.10. Khuẩn lạc C. perfringens ........................................................... 61

Hình 3.11. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C.

perfringens bằng kỹ thuật PCR .................................................. 62

DANH MUÏC CAÙC BIEÅU ÑOÀ

Trang

Biểu đồ 3.1. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong mẫu sữa trên địa bàn

TP. HCM ..................................................................................63

Biểu đồ 3.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại địa bàn

TP. HCM .................................................................................66

Biểu đồ 3.3. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại địa bàn TP. HCM

...................................................................................................68