ứng dụng phương pháp pcr phát hiện edwardsiella ictaluri trực tiếp từ mô cá bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

MAI THỊ LOAN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN

Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN

MAI THỊ LOAN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN

Edwardsiella ictaluri TRỰC TIẾP TỪ MÔ CÁ BỆNH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

KS. NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG

2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

- i -

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực, cố gắng của bản thân có

phần đóng góp rất lớn của Cha Mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng; Thầy

Cô đã có công dạy bảo và tất cả bạn bè luôn bên cạnh tôi giúp đỡ và động viên

tôi.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị

Nguyễn Trúc Phương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi về mọi mặt

trong quá trình tôi thực hiện đề tài.

Chân thành cảm ơn cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Trần Thị Tuyết Hoa cũng

như toàn thể quý thầy cô Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đỡ tôi

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Chân thành cảm ơn chị Trần Việt Tiên, anh Lê Hữu Thôi và các anh chị Bộ

môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

tôi thực hiện đề tài.

Cảm ơn những người bạn thân của tôi cũng như tất cả các bạn lớp Bệnh Học

Thủy Sản 31 đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời

gian học tập tại Giảng đường Đại học cũng như trong quá trình thực hiện đề

tài.

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và Em trai tôi đã luôn là chỗ dựa

tinh thần vững chắc cho tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống.

Mai Thị Loan

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

- ii -

TÓM TẮT

Đề tài thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp ly trích ADN từ mô thận của cá

tra theo phương pháp của Taggart et al. (1992) và tối ưu hóa phương pháp

PCR phát hiện E. ictaluri.

Qui trình ly trích ADN được chuẩn hóa có thời gian thực hiện bằng 1/8 lần qui

trình gốc (Taggart et al, 1992) với hàm lượng Proteinase K sử dụng là 2.5ml

(40mg/ml), thời gian ủ ở bước 1 là 15 phút; hàm lượng RNase là 2.5ml

(2mg/ml), thời gian ủ bước 2 là 30 phút.

Qua thí nghiệm xác định được độ nhạy đối với ADN chiết tách trực tiếp từ

thận có hàm lượng là 50ng, với ADN chiết tách từ vi khuẩn có hàm lượng 0.2

ng. Hai đoạn mồi EiFd-1 và EiRs-1 được xác định là đặc hiệu với vi khuẩn E.

ictaluri. Ngoài ra trong quá trình chuẩn hóa thay đổi hàm lượng Tag DNA

polymerase từ 5U/ml xuống còn 3U/ml.

Thực hiện phản ứng PCR với ADN được chiết tách trực tiếp từ thận với qui

trình đã được tối ưu, phương pháp PCR đã chuẩn hóa phát hiện E. ictaluri ở vị

trí 407bp.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com

- iii -

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ........................................................................................i

TÓM TẮT .............................................................................................ii

MỤC LỤC.............................................................................................iii

DANH SÁCH BẢNG............................................................................vi

DANH SÁCH HÌNH.............................................................................vii

PHẦN I: GIỚI THIỆU...........................................................................1

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU......................................................3

2.1 Sơ lược tình hình nuôi và bệnh trên cá tra ở ĐBSCL........................3

2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri........................................................4

2.2.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E. ictaluri trên thế giới và Việt Nam..4

2.2.1.1 Trên thế giới...............................................................................4

2.2.1.2 Ở Việt Nam................................................................................4

2.2.2 Đặc điểm sinh hóa của loài vi khuẩn E. ictaluri ............................5

2.2.3 Độc lực và một số thí nghiệm gây cảm nhiễm...............................6

2.3 Chiết tách acid nucleic .....................................................................6

2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR).......................................7

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............13

3.1 Thời gian và địa điểm ......................................................................13

3.2 Dụng cụ và hoa chất.........................................................................13

3.2.1 Dụng cụ ........................................................................................13

3.2.1.1 Dụng cụ phân tích mẫu vi khuẩn ................................................13

3.2.1.2 Dụng cụ dùng trong phản ứng PCR............................................13

3.2.2 Hóa chất........................................................................................14

3.2.2.1 Hóa chất dùng phân tích mẫu vi khuẩn.......................................14

3.2.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR...........................................14

3.3 Phương pháp nghiên cứu..................................................................15

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com