Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơn trên cây lúa (Oryza sative L.)

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

---------

CHÂU TẤN PHÁT

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR

VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN

MÙI THƠM TRÊN CÂY LÚA

(Oryza sativa L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Cần Thơ - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

ii

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc

-------------

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu:”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR

và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” này là

của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Châu Tấn Phát

iii

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành biết ơn các Thầy, các Cô hướng dẫn khoa học:

- GS.TS. Nguyễn Thị Lang, đã hết lòng chỉ dẫn những nội dung cần thiết

thực hiện các môn học, các thí nghiệm và nội dung nghiên cứu để hoàn

thành luận án.

- GS.TS. Bùi Chí Bửu, đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung,

phương pháp và kế hoạch triển khai thành công các môn học, thực hiện

các thí nghiệm.

- Các thầy cô tham gia giảng dạy lớp nghiên cứu sinh khóa 1 của cơ sở đào

tạo Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long.

Không thể hoàn thành luận án nếu không có sự giúp đở hướng dẫn khoa học

và động viên của Cô và Thầy.

Xin chân thành biết ơn Hội đồng đánh giá luận án cấp Cơ Sở: đã dành nhiều

thời gian để đọc và đóng góp nhiều ý kiến qúi báu cho luận án được hoàn thiện.

Xin chân thành cảm ơn:

- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

- Ban giám đốc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã giúp đỡ tạo điều

kiện cho tôi trong học tập và thực hiện đề tài.

- Ban giám hiệu Trường Đại Học Cần Thơ.

- Ban giám hiệu và tập thể thầy cô giáo trường đại học Nộng Nghiệp I -

Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều

trong suốt thời gian tôi theo học chương trình cao học tại đây.

- Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu

Long, đã theo dõi, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như

thực hiện đề tài tốt nghiệp.

- Bộ môn Di Truyền và Chọn Giống – Viện Lúa đồng bằng sông Cửu

Long, đã giúp đỡ về trang thiết bị cũng như hướng dẫn chuyên môn trong

suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.

iv

- Bộ môn Công Nghệ Hạt Giống - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã

động viên và tạo điều kiện về thời gian giúp tôi có thể hoàn thành luận án

trong thời gian qui định.

- TS. Bùi Thị Thanh Tâm, TS. Phạm Trung Nghĩa đã đóng góp nhiều ý

kiến quí báu để hoàn thiện cho các môn học chuyên đề và luận án.

- Sau cùng, xin cảm thông sự hy sinh, chia sẽ và động viên của cha mẹ, em

gái, vợ và người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp góp phần

không nhỏ vào sự thành công của luận án.

Tác giả luận án

Châu Tấn Phát

1

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính nuôi

sống hơn 50 % dân số thế giới [62]. Trước đây, với điều kiện vật chất còn thiếu

thốn, lương thực không đủ ăn người ta chỉ có nhu cầu là ăn no. Nhưng ngày nay do

mức sống của người dân ngày càng nâng cao thì nhu cầu ăn no đã thay đổi, việc ăn

ngon, có dinh dưỡng cao dần dần trở thành nhu cầu quan trọng không thể thiếu đối

với con người. Mặt khác, ngày nay nước ta đã qua thời kỳ thiếu lương thực chuyển

sang thời kỳ sản xuất phải có lời và đang xuất hiện những mô hình sản xuất vừa có

lời, vừa bền vững trong môi trường sinh thái trong lành. Một trong những mô hình

này là làm lúa thơm đặc sản, do đó chất lượng gạo được xem như là một trong

những mục tiêu hàng đầu, trong đó mùi thơm được đánh giá rất cao trên thị trường

xuất khẩu gạo của thế giới. Sản lượng gạo thơm từ các giống lúa thơm cổ truyền

như: Tám Thơm, Nàng Thơm Chợ Đào, Séng Cù, Nếp Cái Hoa Vàng, Khao Dawk

Mali, Basmati,... thì có rất ít không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và khó mở rộng

diện tích. Do đó các nhà chọn giống đã liên tục nghiên cứu và lai tạo ra những

giống lúa mới có chất lượng cao và giữ được mùi thơm đặc trưng của giống.

Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của ngành công nghệ sinh học đã

ứng dụng những kỹ thuật trong sinh học phân tử như tái tổ hợp DNA, giải mã chuỗi

trình tự gen. Ứng dụng thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC -

Bacterial Artificial Chromosome) như là một công cụ có sức thuyết phục mạnh mẽ

nhất để xây dựng thư viện bộ gen cho cây lúa, thành lập bản đồ vật lý có chất lượng

cao và dùng để hợp nhất bản đồ vật lý với bản đồ di truyền. Bên cạnh đó, việc sử

dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa cũng

là một trong những ứng dụng từ thư viện BAC.

Xuất phát từ những cấp thiết trên, đề tài: ”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và

dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” được thực

hiện.

2

2.Mục tiêu nghiên cứu

- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr”

trên các dòng giống làm bố mẹ và quần thể con lai nhằm xác định những dòng con

lai có chứa gen mùi thơm.

- Khai thác thư viện BAC để hổ trợ tìm kiếm những chỉ thị liên kết với tính

trạng mùi thơm trên cây lúa.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết với gen “fgr” trên cây

lúa giúp cho việc chọn dòng con lai hiệu quả hơn.

- Xác định những dòng BAC DNA để tạo các chỉ thị mới liên kết với gen qui

định mùi thơm khai thác từ nguồn dòng BAC để hiểu rõ hơn về kỹ thuật dòng hóa

gen mục tiêu, phục vụ nghiên cứu sâu hơn về chức năng gen này.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài đã góp phần bổ sung những dòng lúa có triển vọng biểu thị mùi thơm

thông qua ứng dụng những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết chặt với gen “fgr”

phục vụ cho việc phát triển những giống lúa thơm cao sản ở ĐBSCL.

- Với những kết quả đạt được từ việc khai thác thư viện BAC, đề tài đã tìm

và phân tích chỉ thị mới từ đó chuyển sang chỉ thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ

cho chọn giống lúa.

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trên các đối tượng là các giống lúa mùa và các giống lúa cao

sản hiện đang được duy trì và nhân giống.

- Khai thác thư viện BAC DNA để xác định những dòng BAC chứa gen mùi

thơm.

- Phạm vi nghiên cứu:

+ Chỉ xác định nội dung có liên quan đến các chỉ thị phân tử liên kết

với gen “fgr” trên nhiễm sắc thể số 8 và ứng dụng kết quả trên để chọn giống lúa

cao sản có gen mục tiêu.

3

+ Phân lập được đoạn phân tử mang gen mục tiêu.

+ Chưa phân tích phổ chức năng (gene profile).

+ Chưa nghiên cứu được điều kiện để gen thể hiện (gene expression)

ở các qui mô khác nhau.

4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố môi trường ảnh

hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa

1.1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm và sự thể hiện của chúng trên các bộ

phận của cây lúa

Mùi thơm của hạt gạo được xác định do nhóm formaldehyde, ammonia và

hydrogen sulfide tạo nên. Một vài nghiên cứu còn ghi nhận mùi thơm là do sự tăng

của propanol, pentanol và hexanol trong quá trình tồn trữ. Ngày nay bằng phương

pháp hiện đại đã xác định mùi thơm được tạo thành bởi hàng trăm lọai

hydrocacbon, alcohol, aldehyde, keton, acid, phenol, pyridine và những hợp chất

khác đã được ghi nhận trong cơm [3], [70].

Tác giả Kim [64] báo cáo rằng các hợp phần hydrocacbon không khác nhau

có ý nghĩa giữa lúa thơm và không thơm, tuy nhiên lúa thơm có mức độ cao hơn về

alcohol, aldehyde, keton, acid; trong đó lúa thơm có nồng độ 2-acetyl-1-pyrroline

cao gấp 15 lần so với lúa không thơm.

Lorieux và ctv [76] đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena (thơm) và

IR64 (không thơm), kết quả không tìm thấy chất 2-acetyl-1-pyrroline ở IR64

(không thơm), trong khi đó giống lúa thơm Azucena có hàm lượng cao về chất này.

Trong số 89 hợp chất phân tích, xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt

giữa giống lúa thơm và không thơm đó là: pentanol, 2-acetyl-1-pyrroline,

benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-1,6,10,14-imethylpentadecan-2-1 và hexanol.

Tác giả Buttery và ctv [39] đề nghị rằng sự khác nhau giữa lúa thơm và

không thơm không chỉ ở sự hiện diện hay vắng mặt của chất 2-acetyl-1-pyrroline

mà còn trong sự khác nhau về số lượng của hoạt chất có trong lúa gạo. Nhiều alen

5

của một gen thơm có thể tạo ra sự biến đổi nhỏ trong cùng một enzyme kết quả là

dẫn đến tính thơm khác nhau.

Tác giả Buttery và ctv [40] đã phân tích và xác định 2-acetyl-1-pyrroline (2-

AP) như là một thành phần quan trọng đóng góp vào mùi thơm của các giống lúa

thơm. Theo đánh giá về chất lượng mùi thơm của 2-acetyl-1-pyrroline được mô tả

giống như mùi của ngô nổ. Xác định nồng độ mùi thơm của 10 giống lúa, khoảng

nồng độ từ 6 ppb đến 90ppb với lúa chà trắng. Lúa chưa chà trắng nồng độ 2-acetyl￾1-pyrroline là 100-200ppb. Vì thế có thể nghĩ rằng bề mặt lớp aloron của hạt gạo

giữ một vai trò quan trọng trong việc hình thành mùi thơm của cơm khi nấu. Mũi

của người có thể phát hiện được hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline ở nồng độ

0,007ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan trong điều kiện nhất định và với những

người có khứu giác bình thường kết quả có thể tin tưởng được.[47]

Các tác giả Ahmed và ctv [31], Lin và ctv [74] đã khẳng định lại báo cáo của

Buttery và ctv [40], Paule và ctv [84] rằng 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính

tạo nên mùi đặc trưng cho các giống lúa thơm.

Bên cạnh đó, Buttery và ctv [38] đã phân tích lá của cây lá dứa (Pandabases

amaryllifolius) nhận thấy rằng thành phần bay hơi chính cũng là 2-acetyl-1-

pyrroline (2AP) và có một sự liên hệ rất mật thiết giữa chất 2-acetyl-1-pyrroline

trong lá của cây lá dứa và lúa thơm. Nồng độ của chất 2-acetyl-1-pyrroline trong lá

của cây lá dứa cao hơn gấp 10 lần trong lúa thơm và cao hơn gấp 100 lần trong lúa

không thơm.

Tóm lại, hiện nay có hai quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo.

Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm được tạo ra từ các hợp chất aldehyde

(CHO) và keton (C=O) và các hợp chất với lưu hùynh. Quan điểm thứ hai cho rằng

chất thơm lúa gạo, do vòng ryrrol kiểm sóat tính thơm của chất 2-acetyl-1-pyrroline

[34]. Tác giả Kader và Delseny [59] cho rằng có sự khác nhau trong việc thể hiện

mùi thơm trên các bộ phận của cây lúa, hợp chất 2AP được thể hiện một cách tự

nhiên từ giai đoạn mạ cho đến khi chín và đặc biệt là trong giai đoạn hạt trưởng

thành trên các bộ phận của cây lúa ngoại trừ rễ, mùi thơm được tích lũy nhiều nhất

6

trên bộ phận hạt lúa. Bên cạnh đó, các tác giả Chen và ctv [42], Vanavichit và ctv

[102] cũng khẳng định mùi thơm không thể hiện hoặc thể hiện rất thấp không đáng

kể trên bộ phận rễ lúa.

1.1.1.2 Gen thơm

Li và Gu [71] cũng nghiên cứu về sự di truyền và vị trí của gen thơm trên

lúa. Sự lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm đã cho thấy rằng các gen của

chúng có alen với nhau.

Tác giả Bradbury và ctv [78] đã phân tích mùi thơm của lúa Basmati và

Jasmine với sự thể hiện của 2-acetyl-1-pyrroline. Một gen lặn fgr trên NST số 8 của

lúa qui định sự thể hiện tính trạng quan trọng này và có một gen tương ứng mã hóa

protein có tên gọi là Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD) thể hiện sự đa hình

có ý nghĩa trong vùng chứa gen thơm. Gen fgr có sự tương đồng với gen mã hóa

BAD2 trong lúa và có thể xem gen fgr là một dạng đột biến của gen mã hóa BAD2.

Ngược lại, gen mã hóa BAD1 định vị trên nhiễm sắc thể số 4. Gen mã hóa BAD

liên kết với gen kháng stress trong cây trồng.

Tác giả Shi và ctv [107] cũng kết luận gen fgr là gen lặn nằm trên NST số 8

liên quan đến mùi thơm của lúa. Gen này có một alen lặn mất chức năng bad2 và

alen trội BAD2 mã hóa protein BAD2 làm cho lúa không thơm. Tổng số 34 giống

lúa thơm và không thơm đã được nghiên cứu và giải trình tự đoạn phân tử

BAD2/bad2. Trong số 24 giống lúa thơm có 12 giống chứa alen bad2 (bad2-E7),

với sự kiện mất đi 8 cặp bazơ và 3 SNPs trên exon số 7, số còn lại có một alen bad2

mới (bad2-E2) - chuỗi trình tự tương đồng với bad2-E7 nhưng đã mất đi 7 cặp bazơ

trên exon số 2. Cả hai alen này đều qui định mùi thơm của lúa. Dựa trên chuỗi trình

tự khác nhau giữa BAD2 và 2 alen lặn bad2 đã phát triển những chỉ thị phân tử giúp

cho việc xác định dòng lúa thơm, phân biệt rõ dòng không thơm và thơm xét về

kiểu gen. Tuy nhiên, kiểu hình biểu thị ra bên ngoài vô cùng phức tạp điều này có

thể do điều kiện môi trường qui định sự ức chế hoặc kích hoạt promoter để gen thể

hiện mùi thơm.

7

Bên cạnh đó, tác giả Fitzgerald và ctv [80] cũng đã có nhận xét tương tự với

tác giả Shi và ctv [107]: 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính tạo nên mùi thơm

trong lúa và được tích lũy do bởi sự mất đi 8 cặp bazơ trong một alen ở locus “fgr”.

Trong nghiên cứu này, 2-acetyl-1-pyrroline được định lượng. Sự thể hiện hay vắng

mặt của alen fgr đã được xác định trong 464 mẫu của các giống lúa truyền thống

của Trung Tâm Ngân Hàng Gen IRRI mang tên T.T.Chang. Kết quả cho thấy rằng

nhiều giống lúa thơm, đặc biệt từ Nam và Đông Nam Á, không biểu thị sự mất đi 8

cặp bazơ, nhưng sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline vẫn được xác định trong cả dạng

gạo và dạng cơm của những giống này. Sự mất đi 8 cặp bazơ trong locus fgr không

chỉ là nguyên nhân qui định mùi thơm mà còn có một đột biến khác đã điều khiển

sự tích lũy sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline. Protein tổng số 2-acetyl-1-pyrroline được

mã hóa bởi những gen đồng dạng fgr không biểu thị khác biệt có ý nghĩa so với

kiểu gen n-fgr. Một vài kiểu gen fgr, đặc biệt từ Nam Á mã hóa protein này với sự

tích lũy số lượng lớn 2-acetyl-1-pyrroline như Basmati. Sự đột biến tạo ra 2-acetyl￾1-pyrroline trong các giống lúa thơm n-fgr có thể được tạo ra một vài lần trong quá

trình thuần hóa và tiến hóa. Gen fgr và các alen khác liên quan tới 2-acetyl-1-

pyrroline đã qui tụ lại trong các giống lúa thơm ở Nam Á tạo ra các giống lúa đặc

sản cổ truyền có mùi thơm cao. Sự xác định nhiều đột biến đối với 2-acetyl-1-

pyrroline có thể xảy ra trong các chương trình chọn giống lúa để đa dạng nguồn di

truyền của 2-acetyl-1-pyrroline nhằm phát triển giống lúa có mùi thơm cao và chất

lượng tốt.

1.1.1.3 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi

thơm trên lúa

+ Nhiệt độ

Theo tác giả Juliano [57b] việc hình thành mùi thơm trong hạt tăng lên ở

nhiệt độ thấp trong suốt giai đoạn vào chắc của hạt. Giống lúa Basmati yêu cầu

nhiệt độ thấp (25oC ban ngày, 21oC ban đêm trong suốt quá trình trưởng thành) thì

tốt cho việc hình thành mùi thơm.

8

+ Đất

Nhân tố đất cũng ảnh hưởng đến mùi thơm và các tính trạng chất lượng khác

thông qua dinh dưỡng cây trồng và mối quan hệ tương tác của các chất dinh dưỡng

bay hơi với các thành phần bay hơi có liên quan đến mùi thơm. Singh và ctv [94]

nhận thấy có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về mùi thơm của lúa ở hai thửa

ruộng liền kề nhau mặc dù là cùng một giống. Điều kiện đất tơi xốp và đất vùng cao

cũng giúp hình thành mùi thơm được tốt hơn.

Bên cạnh đó, Bocchi và ctv [36] đã đánh giá sự ảnh hưởng của các đặc tính

đất trên chất lượng mùi thơm của lúa trên ruộng thử nghiệm ở Pavia, Italy và kết

luận rằng hàm lượng cao nhất của các chất bay hơi trong hạt có liên quan đến các

loại đất có hàm lượng sét thấp và hàm lượng cát cao. Ảnh hưởng của tương tác kiểu

gen và đất trên chất lượng hạt lúa của lúa Japonica thì cũng được báo cáo bởi Lee

và ctv [68].

+ Tập quán canh tác

Theo Singh và ctv [94] lúa sẽ có mùi thơm hơn khi cây lúa được sạ trực tiếp

so với khi được cấy. Bên cạnh đó thời gian thu hoạch là một nhân tố khác có ảnh

hưởng đến mùi thơm và những tính trạng chất lượng khác ở lúa. Việc trì hoản thu

hoạch sau khi chín có thể làm giảm mùi thơm. Cả năng suất và phẩm chất hạt sẽ

giảm đi nếu việc thu họach vượt quá thời gian này. Sự tác động của việc trì hoãn thu

họach trên phẩm chất lúa gạo thông qua sự giảm hay thay đổi trong các thành phần

hạt do bởi nhiệt độ, ẩm độ, côn trùng dịch hại và các vi sinh vật khác.

+ Độ thuần giống

Theo Singh và Singh [93] trong hầu hết các vùng trồng lúa thơm bản địa ở

Ấn Độ, người nông dân thường sử dụng hạt của các thế hệ trước. Không có chương

trình cải thiện năng suất cho các giống lúa này. Kết quả là hạt không thuần dẫn đến

việc giảm đi mùi thơm.

Tóm lại, các thành phần di truyền, tập quán canh tác, môi trường và các nhân

tố khác có ảnh hưởng đến sự thể hiện của mùi thơm và các tính trạng chất lượng

trên lúa thơm. Cùng một giống được trồng ở các nơi khác nhau có thể không sản