Ứng dụng chỉ thị phân tử để nhận diện các gen kháng bệnh bạc lá, bệnh đạo ôn và chất lượng gạo nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa (Oryza sativa L.) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ VIỆT NAM"

NĂM 2014 DÀNH CHO SINH VIÊN

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ NHẬN DIỆN CÁC

GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ, BỆNH ĐẠO ÔN VÀ CHẤT

LƯỢNG GẠO NHẰM PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN

TẠO GIỐNG LÚA (Oryza sativa L.) Ở VIỆT NAM.

Thuộc nhóm ngành khoa học (NN): Khoa học Nông nghiệp

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ VIỆT NAM"

NĂM 2014 DÀNH CHO SINH VIÊN

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ NHẬN DIỆN CÁC

GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ, BỆNH ĐẠO ÔN VÀ CHẤT

LƯỢNG GẠO NHẰM PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN

TẠO GIỐNG LÚA (Oryza sativa L.) Ở VIỆT NAM.

Thuộc nhóm ngành khoa học (NN): Khoa học Nông nghiệp

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2014

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................VII

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................IX

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.....................................................................................XI

PHẦN 1.............................................................................................................................1

MỞ ĐẦU...........................................................................................................................1

1.1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI............................................................................2

1.2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI..................................................................................................3

1.3.ĐỐI TƯỢNG – PHẠM VI NGHIÊN CỨU.............................................................4

1.3.1.Đối tượng .................................................................................................................4

1.3.2.Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................4

1.4.NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC.........................................................4

1.5.TỔNG QUAN VỀ LÚA.............................................................................................6

1.5.1.Định nghĩa và tầm quan trọng ..............................................................................6

1.5.2.Nguồn gốc và vị trí phát sinh.................................................................................7

1.5.3.Phân loại ..................................................................................................................7

1.6.BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA ..................................................................................10

1.6.1.Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa.........................................................................10

1.6.2.Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa. ......................................................................10

1.6.2.1.Nguồn gốc của bệnh bạc lá lúa..........................................................................10

1.6.3.Di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa .................................................................12

1.6.3.1.Nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá ..............................................................12

1.6.3.2.Tình hình nghiên cứu sử dụng gen kháng bệnh bạc lá trong chọn tạo giống lúa

ở Việt Nam. .....................................................................................................................13

II

1.6.3.3.Đặc điểm gen kháng Xa7 và gen kháng Xa21 và các chỉ thị phân tử liên kết gen

kháng bạc lá:...................................................................................................................14

1.7.BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA .................................................................................16

1.7.1.Triệu chứng bệnh đạo ôn .....................................................................................16

1.7.2.Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn ............................................................................16

1.7.2.1.Nguồn gốc bệnh đạo ôn......................................................................................16

1.7.2.2.Nguyên nhân gây bệnh.......................................................................................17

1.7.3.Đặc điểm di truyền về tính kháng bệnh đạo ôn lúa...........................................17

1.7.4.Tình hình nghiên cứu sử dụng gen kháng đạo ôn trong chọn tạo giống lúa ở

Việt Nam.........................................................................................................................21

1.8.CÁC YẾU TỐ CẤU THÀNH CHẤT LƯỢNG GẠO TRÊN CÂY LÚA...........22

1.8.1.Gia tăng phẩm chất lúa gạo.................................................................................22

1.8.2.Phân tích đặc tính hóa học cấu thành nên amylose ..........................................23

1.8.2.1.Cấu tạo amylose: ................................................................................................23

1.8.2.2.Hàm lượng amylose: ..........................................................................................23

1.8.3.Vùng gen qui đinh amylose..................................................................................24

1.8.3.1.Nghiên cứu về gen qui định amylose: ...............................................................24

1.8.3.2.Tình hình nghiên cứu sử dụng gen qui định amylose trong chọn tạo giống ở

Việt Nam: ........................................................................................................................27

1.9.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................29

1.9.1.Vật liệu nghiên cứu...............................................................................................29

1.9.1.1.Vật liệu sử dụng cho xây dựng quy trình nhận diện gen kháng bạc lá...........29

Mồi sử dụng cho nghiên cứu:........................................................................................30

1.9.1.2.Vật liệu sử dụng cho xây dựng quy trình nhận diện gen kháng đạo ôn .........30

Mồi sử dụng cho nghiên cứu:........................................................................................31

III

1.9.1.3.Vật liệu sử dụng cho xây dựng quy trình nhận diện gen qui định hàm lượng

amylose............................................................................................................................33

Mồi sử dụng cho nghiên cứu:........................................................................................34

Vật liệu sử dụng cho đánh giá tính kháng đạo ôn, bạc lá và hàm lượng amylose .....35

1.9.2.Phương pháp thực hiện:.......................................................................................36

1.9.2.1.Phương pháp tách chiết DNA genome của các giống lúa: ..............................36

Quy trình:........................................................................................................................37

1.9.2.2.Phương pháp PCR - SSR ...................................................................................39

Nguyên lý:.......................................................................................................................39

Quy trình phản ứng PCR-SSR: .....................................................................................42

1.9.2.3.Phương pháp tối ưu quy trình PCR-SSR:.........................................................43

1.9.2.4.Phương pháp điện di và đọc kết quả sản phẩm PCR-SSR:..............................43

Nguyên lý:.......................................................................................................................43

Quy trình điện di: ...........................................................................................................44

1.9.2.5.Phương pháp nhuộm gel sử dụng bạc nitrate: .................................................45

Nguyên lý:.......................................................................................................................45

Quy trình nhuộm bạc gồm các bước:............................................................................46

PHẦN 2...........................................................................................................................46

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN..............................................................46

2.1.KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR-SSR & STS....................................47

2.1.1.Kết quả tách chiết DNA .......................................................................................47

2.1.2.Kết quả đánh giá chỉ thị sử dụng trong đánh giá kiểu gen kháng bạc lá........48

2.1.2.1.Kết quả đánh giá sở bộ về chỉ thị pTA248 và RM5509: ...................................48

2.1.2.2.Kết quả tối ưu phản ứng PCR-SSR/STS của chỉ thị liên kết gen kháng bạc lá

.........................................................................................................................................51

2.1.2.3.Kết quả khảo sát độ lặp lại của qui trình tối ưu ở trên với tính kháng bạc lá.52

IV

Khảo sát tính kháng bạc lá trên 17 mẫu lúa là con lai của dòng ưu tú ......................52

2.1.3.Kết quả đánh giá sơ bộ về chỉ thị liên kết gen kháng đạo ôn ...........................56

2.1.4.Kết quả đánh chỉ thị RM190 liên kết gen Wx qui định hàm lượng amylose..58

2.1.4.1.Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng PCR-SSR của chỉ thị liên kết tính trạng

amylose............................................................................................................................58

2.1.4.2.Khảo sát gen Wx qui đinh hàm lượng amylose trên 43 mẫu lúa là con lai của

dòng ưu tú .......................................................................................................................59

2.1.5.Khảo sát tính kháng bạc lá, đạo ôn, hàm lượng amylose trên 21 giống lúa. ..61

2.1.5.1.Khảo sát tính kháng bạc lá.................................................................................61

2.1.5.2.Khảo sát tính kháng đạo ôn ...............................................................................63

2.1.5.3.Khảo sát chỉ thị liên kết với gen qui định hàm lượng amylose ........................67

3.1.KẾT LUẬN:.............................................................................................................71

3.2.ĐỀ NGHỊ:.................................................................................................................73

TÀI LIỆU THAM KHẢO: ...........................................................................................74

PHỤ LỤC .......................................................................................................................84

PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CỦA 43 MẪU LÚA.........................84

PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 21 GIỐNG LÚA ..............................87

V

DANH MỤC BẢNG

PHẦN 1 – MỞ ĐẦU

Bảng 1.1. Tổng giá trị gạo xuất khẩu của Việt Nam ........................................................ 6

Bảng 1. 2. Nguồn gốc phân loài ........................................................................................ 8

Bảng 1.3. Đặt tính sinh hóa. .............................................................................................. 9

Bảng 1.4.Một số gen kháng đạo ôn quan trọng....................................................... 20

Bảng 1.5. Hệ thống đánh giá hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn viện lúa IRRI (1988).

........................................................................................................................................... 24

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1. Các mẫu lúa được sử dụng để nghiên cứu tính ổn định của chỉ thị liên kết

với gen kháng bạc lá..........................................................................................................29

Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng cho xác định gen Xa7 và Xa21....................................30

Bảng 2.3. Các mẫu lúa được sử dụng để nghiên cứu nhận diện gen kháng đạo ôn.....30

Bảng 2.4. Trình tự mồi sử dụng cho xác định gene kháng đạo ôn.................................31

Bảng 2.5. Các mẫu lúa được sử dụng để nghiên cứu tính ổn định của chỉ thị liên kết

với gen Waxy qui định hàm lượng amylose .....................................................................32

Bảng 2.6. Trình tự mồi sử dụng cho xác định hàm lượng amylose trên lúa .................33

Bảng 2.7. Các giống lúa được sử dụng để nghiên cứu tính kháng đạo ôn, bạc lá và chỉ

thị liên kết với gen Waxy qui định hàm lượng amylose...................................................34

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR.............................................................................40

Bảng 2.9. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................................40

Bảng 2.10. Thành phần gel polyacrylamide 4,5% ...........................................................42

Bảng 2.11. Tóm tắt quy trình nhuộm bạc nitrate.............................................................44

PHẦN 2 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Bảng 3.1.a. Kết quả phân tích mẫu gen kháng Xa21 với kết quả kiểu hình mẫu lúa đã

được kiểm tra. ....................................................................................................................53

Bảng 3.2. Kết quả băng hình qua đánh giá sơ bộ 7 chỉ thị liên kết gen kháng đạo ôn

trên gel polyacrylamed 4,5% .............................................................................................56

Bảng 3. 3. Bảng đánh giá tương quan giữa kiểu tính trạng qui định amylose và kiểu

hình amylose trên 44 mẫu lúa...........................................................................................59

VI

Bảng 3.4. Kết quả băng hình 7 chỉ thị liên kết gen kháng bạc lá trên gel polyacrylamide

4,5% của 21 mẫu lúa .........................................................................................................64

Bảng 3.5. Phân nhóm gen kháng và nhóm lúa mang gen kháng so sánh với đánh giá

kiểu hình ............................................................................................................................65

Bảng 3.6. Kết quả đánh giá hàm lượng amylose bằng chỉ thị RM190 so sánh với kiểu

hình và bảng phân nhóm 1.5 ............................................................................................68

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá tương quan kiểu gen và kiểu hình kháng bạc lá, đạo ôn và

hàm lượng amylose trên 21 giống lúa ..............................................................................69

VII

DANH MỤC HÌNH

PHẦN 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1. Bản đồ vật lý gen Xa7 dựa trên sự mô tả của Shen Chen và cộng sự (2007).

........................................................................................................................................... 15

Hình 1.2. Vị trí của Osin06 và Osin08 với alen Xa21 kháng bạc lá (tham khảo). Nguồn

từ Anirudh Kumar và cộng sự (2011).............................................................................. 15

Hình 1.3. Phân loài nhóm gen qui định amylose ........................................................... 25

Hình 1. 4. Trình tự SSR vùng nu đột biến, tham khảo từ Hirano và cộng sự. ............. 26

PHẦN 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1: Mẫu đã thêm CTAB. ....................................................................................... 36

Hình 2.2: Mẫu đang ủ...................................................................................................... 37

Hình 2.3: Mẫu sau khi ủ.................................................................................................. 37

Hình 2.4: Mẫu thêm chlorofom - IAA. ........................................................................... 37

Hình 2.5: Mẫu sau ly tâm lần 1 ....................................................................................... 37

Hình 2.6: Mẫu đã thêm isopropanol................................................................................ 37

Hình 2.7: Mẫu sau ly tâm lần 2 ....................................................................................... 37

Hình 2.8: Thu tủa DNA ................................................................................................... 37

Hình 2.8: Rửa tủa DNA với ethanol.................................................................................37

PHẦN 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA trên gel agarose 1% ..................................................46

Hình 3.2. Kết quả chạy kiểm tra chỉ thị Xa21 trên các dòng chuẩn kháng, chuẩn nhiễm

trên gel agarose 2%. ..........................................................................................................47

Hình 3.3. Kết quả chạy kiểm tra chỉ thị Xa7 trên các dòng chuẩn kháng, chuẩn nhiễm

trên gel agarose 2% ...........................................................................................................48

Hình 3.4. Chạy chỉ thị Xa7 trên gel polyacrylamide 4,5%. .............................................49

Hình 3.5. Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu của mồi Xa21 trên gel agarose 2%.............50

Hình 3.6. Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu của mồi Xa7 ................................................50

VIII

Hình 3.7. Kết quả sản phẩm băng hình mẫu Xa21 trên gel agarose 2%........................51

Hình 3.8. Kết quả chạy băng hình của mẫu Xa7 trên gel polyacrylamide 4,5%............52

Hình 3.9. Sản phẩm băng hình RM27933 trên gel polyacrylamide 4,5% ......................55

Hình 3.10. Sản phẩm băng hình RM1261 trên gel polyacrylamide 4,5% ......................55

Hình 3.11. Sản phẩm băng hình RM28130 trên gel polyacrylamide 4,5% ....................55

Hình 3.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu của mồi Wx trên gel agarose 2%..............57

Hình 3.13. Kết quả băng hình 43 mẫu lúa chạy PCR với RM190 trên gel

polyacrylamide 4,5%..........................................................................................................58

Hình 3.14. Kết quả băng hình 21 giống lúa chạy PCR với pTA248 trên gel agarose 2%

............................................................................................................................................61

Hình 3.15. Kết quả băng hình 21 giống lúa chạy PCR với RM5509 trên gel

polyacrylamide 4,5%..........................................................................................................62

Hình 3.16. Sản phẩm băng hình 21 giống lúa chạy PCR với RM27933 trên gel

polyacrylamide 4,5%..........................................................................................................62

Hình 3.17. Sản phẩm băng hình 21 giống lúa chạy PCR với RM21830 trên gel

polyacrylamide 4,5%..........................................................................................................63

Hình 3.18. Sản phẩm băng hình 21 giống lúa chạy PCR với RM1261 trên gel

polyacrylamide 4,5%..........................................................................................................63

Hình 3.19. Sản phẩm băng hình 21 giống lúa chạy PCR với RM190 trên gel

polyacrylamide 4,5%..........................................................................................................67

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình thực hiện tổng quát phát hiện đặc tính gen kháng và đặc tính hàm

lượng amylose dựa trên marker....................................................................................... 36