Tuyển chọn mọt số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao thuộc chi streptomyces

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TUYỂN CHỌN

CÓ HOẠT TÍNH CAO

STREPTOMYCES

, 8 - 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TUYỂN CHỌN

CÓ HOẠT TÍNH CAO

STREPTOMYCES

: 60 42 01 14

, 8 - 2013

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

CHỮ KÝ CỦA GIÁO VIÊN

HƯỚNG DẪN

PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

XÁC NHẬN CỦA KHOA

Công

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Chất kháng sinh là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ các hoạt

động sống của các sinh vật, nó có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một cách

chọn lọc đối với vi sinh vật ngay cả nồng độ thấp.

Việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng có hiệu quả nhiều loại kháng sinh

có ý nghĩa rất lớn đối với y học nói riêng và sản xuất nói chung. Trong y học,

chất kháng sinh đã được sử dụng để cứu hàng triệu người khỏi các bệnh

nhiễm trùng. Trong nông nghiệp, chất kháng sinh được sử dụng để chữa bệnh

làm tăng trọng cho vật nuôi và phòng trừ dịch bệnh cho cây trồng. Vì vậy, vai

trò của chất kháng sinh là vô cùng to lớn với đời sống con người.

t kháng sinh đã

được mô tả, Streptomyces.

, một mặt cải biến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng

kháng thuốc, mặt khác thúc đẩy nghiên cứu để tìm ra các chất kháng

sinh mới.

Việt Nam là nước nông

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2

: “Tuyển ch

Streptomyces”

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao,

chọn 01 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất kháng vi khuẩn gây bệnh trên

người.

3. Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh

cao.

- Phân loại 01 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng cao nhất kháng vi

khuẩn gây bệnh trên người bằng phương pháp truyền thống và sinh học phân

tử.

- Nghiên cứu điều kiện lên men chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn

được chọn.

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN

1.1.1. Đặc điểm hình thái và phân loại xạ khuẩn

* Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Theo Nguyễn Lân Dũng và đtg (2008), tế bào xạ khuẩn (XK) có dạng sợi

phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn ngang. Hệ sợi của XK

chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.

Khuẩn ty cơ chất (KTCC) cắm sâu vào môi trường, có chức năng chủ

yếu là dinh dưỡng và làm giá thể. Đường kính KTCC thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm,

khuẩn ty không có vách ngăn và không bị đứt đoạn.

Khuẩn ty khí sinh (KTKS) của XK phát triển ra bên ngoài không khí,

trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc XK. Khuẩn lạc XK dạng hình

tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng

tâm. Khuẩn lạc của XK không trơn ướt như khuẩn lạc của vi khuẩn, nấm men

mà có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình

phóng xạ vì vậy mới có tên là XK. Dùng que cấy không di được khuẩn lạc

của XK vì KTCC bám sâu vào trong thạch. Khuẩn lạc XK có thể mang các

màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…[4].

* Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân

bố rộng rãi trong tự nhiên. Hầu hết XK thuộc nhóm Gram dương, hiếu khí và

sống hoại sinh. XK có khả năng sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan

trọng như các chất kháng sinh và enzyme, do đó chúng đóng vai trò to lớn

trong nghiên cứu khoa học, y học và công nghiệp [4].

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

4

Sự tồn tại của XK được thừa nhận và biết đến hơn một trăm năm nay.

Ban đầu, xạ khuẩn được xem là một nhóm VSV vì chúng có nhiều đặc điểm

tương đồng với cả vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, việc xác định được thành

phần hóa học và cấu trúc của XK từ những năm 1950 đã xác nhận XK thuộc

nhóm Prokaryote. Trong số 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố

thì có khoảng 100 chi và 1000 loài XK. Mặc dù XK thuộc nhóm sinh vật nhân

sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và hình thành nhiều bào tử.

Ngày nay, XK được xếp vào bộ Actinomycetales theo hệ thống phân loại của

Bergey hoặc Actinomycetes theo hệ thống phân loại của Kracinhicop, gồm 10

dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài xạ khuẩn đã được

công bố thuộc chi Streptomyces, hơn 500 loài thuộc các chi còn lại và được

xếp vào nhóm XK hiếm. Hình thái luôn là đặc điểm chung để nhận dạng và

định danh XK [50],[53].

1.1.2. Cấu tạo tế bào và sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

* Cấu tạo tế bào của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào,

màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.

Thành tế bào của XK có dạng lưới, dày 10 - 20nm có tác dụng duy trì

hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh

chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid

và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất

và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.

Nguyên sinh chất và nhân tế bào XK có điểm khác biệt so với các sinh

vật Prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn

55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45%.

Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt

poliphotphate, các hạt polisaccarid [2],[4].

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

5

* Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí

sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của XK có dạng thẳng hoặc

lượn sóng, dạng xoắn lò xo hay xoắn ốc.

Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử

theo hai cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với

mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông. Hình

thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân

loại xạ khuẩn.

Bào tử của XK được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu

protein với độ dày khoảng 300 400 A0

chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho

bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ,

pH… [2].

1.1.3. Đặc điểm bộ gen và tính bất ổn định di truyền của xạ khuẩn

Do các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces chiếm phổ biến nên các

nghiên cứu về XK chủ yếu là nghiên cứu trên các loài thuộc chi Streptomyces.

Kết quả nghiên cứu dưới kính hiển vi điện tử và quang học cho thấy các

chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có DNA ở dạng đậm đặc, có nhiều bản sao

trong tế bào hệ sợi, nhưng thường chỉ có một bản sao trong bào tử.

Kích thước bộ gen điển hình ở Streptomyces thường từ 5 - 7Mb, có khi

lên đến 8Mb, có tỷ lệ G+C cao và thường chứa nhiều trình tự lặp lại. Các

trình tự DNA lặp lại được tìm thấy với số lượng lớn trong Streptomyces sp, có

kích thước khoảng từ 2,9 - 93Kb, có thể lên đến 500 bản sao, được cho là một

trong các nguyên nhân gây ra sự bất ổn định về gen ở XK.

Điểm thú vị ở các XK là tính bất ổn định về gen với tỷ lệ đột biến cao

hơn 0,001. Đột biến xảy ra không những do bị xử lý bởi các tác nhân gây đột

biến mà cũng có thể xảy ra khi chủng được bảo quản trong điều kiện lạnh.

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

6

Tính bất ổn định này có nguyên nhân từ sự tái sắp xếp lại nhiễm sắc thể,

có thể do các trình tự lặp lại và cấu trúc DNA mạch thẳng ở XK với sự hiện

diện của nhiều trình tự lặp lại ngược chiều (TIR: terminal inverted repeat) ở

những vùng cụ thể trên nhiễm sắc thể được gọi là vùng không ổn định [32].

Tính bất ổn định của bộ gen của XK còn là hệ quả của đặc điểm phát

triển hệ sợi với các tế bào nhiều nhân ở XK và sự tạo thành bào tử. Mặt khác,

tỷ lệ G + C cao trong bộ gen, với các cụm GC nằm ngoài vùng mã hóa, hình

thành nhiều trình tự lặp lại với tần suất cao là nguyên nhân của cấu hình DNA

đặc biệt hình thành nền tảng cho việc tái tổ hợp dẫn đến sự mất đoạn hoặc

tăng bản sao các trình tự lặp lại. Sự bất ổn định gen ảnh hưởng đến tất cả các

mặt của sự phát triển Streptomycetes bao gồm quá trình chuyển hóa sơ cấp,

quá trình biệt hóa nhưng tác động mạnh đến các tính trạng của quá trình trao

đổi chất thứ cấp. Hiện tượng này khá phổ biến trong chi Streptomyces và tạo

cho XK nhiều kiểu hình khác nhau.

Mặc dù có tính bất ổn định bộ gen cao nhưng tế bào XK vẫn có thể chịu

đựng những sự thay đổi to lớn do sự mất đồng thời một lượng lớn thông tin di

truyền. Ở Streptomyces glaucescens, việc mất khoảng 800Kb DNA gen đã

làm suy yếu khả năng sống của tế bào nhưng chủng này vẫn có thể phát triển

được trên môi trường nghèo dinh dưỡng. Điều này chứng tỏ rằng chúng

không mất bất kỳ các gen thiết yếu nào, vùng gen bị mất có thể chỉ liên quan

đến quá trình trao đổi chất thứ cấp [44]. Nhiều loài XK có chứa plasmid mạch

thẳng có kích thước lớn. Plasmid ở Streptomyces có kích thước rất đa dạng từ

4Kb đến 170Kb, gồm nhiều bản sao trên một nhiễm sắc thể, có lẽ liên quan

đến việc kiểm soát các đặc điểm về kiểu hình như khả năng sinh sản, khả

năng sinh kháng sinh và kháng kháng sinh, sự biệt hóa…