Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

-------------------------

Nguyễn Thị Hà

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM

SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ

KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME

CHITINASE CAO

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Luận văn này là công trình nghiên cứu khoa học của tôi

- Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố

Tác giả luận văn

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy là giảng viên khoa sinh học trường

Đại học su phạm TP HCM, người đã định hướng đề tài cho tôi, quan tâm, giúp đỡ và thông cảm cho

hoàn cảnh của tôi. Người đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi, đã nhiệt tình

hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cám ơn TS. Dương Thị Hương Giang là giảng viên giảng dạy môn Enzyme

học, viện công nghệ sinh học trường Đại học Cần Thơ, người đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình

thực hiện đề tài

Tôi xin cám ơn các em sinh viên: Phạm Thị Mỹ Ánh, Cao Thị Mỹ Phương, Nguyễn Huỳnh

Trang Thu Hương, Nguyễn Trần Khiết lớp Công nghệ sinh học tiên tiến K33, Quang Anh Thư,

Trần Kim Thoa, Vương Thị Hồng Thắm lớp Sư phạm Sinh học K34 đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong

quá trình thực nghiệm và tổng hợp kết quả.

Tôi xin cám ơn cha mẹ, chồng và các người thân của tôi, những người đã chăm sóc cho con tôi,

và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình đi học và thực hiện đề tài.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011

Nguyễn Thị Hà

MỤC LỤC

15TLỜI CAM ĐOAN15T ................................................................................................................................ 2

15TLỜI CÁM ƠN15T...................................................................................................................................... 3

15TMỤC LỤC15T ........................................................................................................................................... 4

15TDANH MỤC VIẾT TẮT15T ..................................................................................................................... 8

15TMỞ ĐẦU15T .............................................................................................................................................. 1

15TChương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU15T ................................................................................................. 2

15T1.1. NS trong hệ sinh thái RNM15T...................................................................................................... 2

15T1.1.1. Giới thiệu về RNM15T ............................................................................................................. 2

15T1.1.2. Đặc điểm sinh học NS ở RNM15T .......................................................................................... 3

15T1.1.2.1. Đặc điểm hình thái15T ....................................................................................................... 3

15T1.1.2.2. Đặc điểm sinh sản15T ........................................................................................................ 4

15T1.1.2.3. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa15T .......................................................................................... 4

15T1.1.2.4. Đặc điểm phân loại nấm sợi15T......................................................................................... 7

15T1.1.2.5. Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM15T ........................................................................9

15T.2. Chitin và chitinase15T ................................................................................................................ 10

15T1.2.1. Nguồn chitin:15T ................................................................................................................... 10

15T1.2.2. Chitinase15T ........................................................................................................................... 13

15T1.2.2.1. Nguồn chitinase:15T ........................................................................................................ 13

15T1.2.2.2. Cơ chế hoạt động:15T ...................................................................................................... 13

15T1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase:15T .................................................................. 14

15T1.2.2.4. Tính chất sinh hóa của chitinase15T ................................................................................. 14

15T1.2.2.5. Phân loại chitinase15T ..................................................................................................... 15

15T1.2.2.6. Ứng dụng của chitinase15T .............................................................................................. 16

15T1.2.3. NS với khả năng sinh enzyme chitinase15T ........................................................................... 19

15T1.2.3.1. Một số chủng NS có HT chitinase cao15T........................................................................ 19

15T1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp chitinase ở NS15T ............................................... 20

15T1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitinase trong và ngoài nước 15T ............................................ 21

15T1.3.1. Ngoài nước15T...................................................................................................................... 21

15T1.3.2. Trong nước15T....................................................................................................................... 24

15TChương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP15T.................................................................................. 25

15T2.1. Vật liệu15T .................................................................................................................................... 25

15T2.1.1. Đối tượng nghiên cứu15T ...................................................................................................... 25

15T2.1.2. Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ15T ......................................................................... 25

15T2.1.3. Môi trường15T ....................................................................................................................... 26

15T2.2. Phương pháp nghiên cứu15T ....................................................................................................... 27

15T2.2.1. Phương pháp kích hoạt giống15T .......................................................................................... 27

15T2.2.2. Phương pháp bảo quản nấm sợi15T ...................................................................................... 27

15T2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS15T .............................................................. 28

15T2.2.4. Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5]15T ............................................................. 28

15T2.2.5. Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng KL15T ...............29

15T2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT bán rắn thu enzyme chitinase15T ................................. 29

15T2.2.7. Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy15T .......................................... 29

15T2.2.8. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường

kính vòng phân giải15T ................................................................................................................... 30

15T2.2.9. Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu15T ................30

15T2.2.10. Phương pháp định lượng protein [8]15T ............................................................................. 33

15T2.2.11 Khảo sát MT và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase của các chủng

NS. [4], [10], [23], [32], [33]15T ...................................................................................................... 35

15T2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong MT nuôi cấy15T ..................................... 35

15T2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuôi cấy15T....................................................................................... 35

15T2.2.11.3. Khảo sát pH của MT15T ................................................................................................ 35

15T2.2.11.4. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy15T ....................................................................................... 36

15T2.2.11.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl15T .................................................................... 36

15T2.2.11.6. Khảo sát hàm lượng cơ chất chitin15T ........................................................................... 36

15T2.2.12. Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm P. citrinum bằng qui hoạch thực nghiệm [10], [17]15T.....36

15T2.2.13. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum [4], [43], [44]15T .............39

15T2.2.13.1. Thu nhận tủa protein15T ................................................................................................ 39

15T2.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CPE chitinase thô [9]15T ......................... 39

15T2.2.13.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của chitinase15T..................................................... 39

15T2.2.14. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani của

chế phẩm enzyme chitinase [4], [20]15T .......................................................................................... 40

15T2.2.15. Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm

[4], [46]15T....................................................................................................................................... 41

15TChương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN15T......................................................................................... 42

15T3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ15T

........................................................................................................................................................ 42

15T3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng thu được15T ................................................. 43

15T3.2.1. Chủng nấm số 1615T ............................................................................................................. 43

15T3.2.2. Chủng nấm số 1015T ............................................................................................................. 45

15T3.3. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2

chủng NS P. citrinum và A. protuberus15T ......................................................................................... 47

15T3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn C trong MT nuôi cấy15T................................................................... 47

15T3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy15T .................................................................................. 48

15T3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy15T ............................................................................. 51

15T3.3.6. Ảnh hưởng của HL chitin trong MT nuôi cấy15T ................................................................. 53

15T3.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả

năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P. citrinum15T ................................................................ 55

15T3.4. Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P. citrinum15T ........................................ 58

15T3.4.1. Thu nhận CP chitinase thô bằng muối (NHR

4R)R

2 RSOR

4 R15T ......................................................... 58

15T3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CP chitinase15T ............................................ 58

15T3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của CPE chitinase thô15T ........................................... 60

15T3.5. Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thô để phòng trừ nấm hại cây trồng15T ........62

15T3.5.1. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani15T.62

15T3.5.2. Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm15T 64

15TChương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ15T ......................................................................................... 66

15T4.1. Kết luận15T ................................................................................................................................... 66

15T4.2. Kiến nghị15T................................................................................................................................. 67

15TTÀI LIỆU THAM KHẢO15T................................................................................................................. 67

15TPHỤ LỤC15T........................................................................................................................................... 74

15TPHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE15T ............................................................... 74

15TPHỤ LỤC 2 – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD15T ..................................................................... 75

15TPHỤ LỤC 3. CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM15T ............................................................................... 76

15TPHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH15T ................................................................................................ 77

15TPHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 2 CHỦNG NS NGHIÊN CỨU15T .......................................... 79

DANH MỤC VIẾT TẮT

BT: bào tử

BSA: Bovine serum albumin

CPE: chế phẩm enzyme

DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit

HT: hoạt tính

HTC: hoạt tính chung

HTR: hoạt tính riêng

HL: hàm lượng

KL: khuẩn lạc

MT: môi trường

NC: nuôi cấy

OD: mật độ quang

∆OD: hiệu số giữa mật độ quang của mẫu đối chứng và mẫu thật

PTHQ: phương trình hồi qui

RNM: rừng ngập mặn

U: đơn vị hoạt độ enzyme

TTN: thuốc trừ nấm

MỞ ĐẦU

RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt ở đây đã làm

cho sinh vật, cũng như NS có tính thích nghi cao và tạo ra sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so với

điều kiện khác. Hệ vi sinh vật ở đây rất đa dạng, phong phú, sinh tổng hợp nhiều chất có HT sinh học

như các loại enzyme xenlulase, protease, chitinase, lipase… và chất kháng sinh để có thể phân hủy các

chất có trong hệ sinh thái RNM thường xuyên bị ô nhiễm.

Một trong những nguồn rác thải dồi dào ở RNM đó là các loại vỏ của động vật chân khớp ở biển

như: tôm, cua, ghẹ…có thành phần chủ yếu là chitin. Chitin là chất khó phân hủy. Có thể sử dụng

nhiều biện pháp hóa lý khác nhau để phân hủy chitin nhưng chi phí rất cao. Hiện nay người ta đã

nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi

khuẩn, nấm… nhưng chỉ có enzyme chitinase do vi sinh vật tổng hợp đặc biệt là do nấm tổng hợp mới

có HT cao, ổn định với nhiệt độ và pH.

Ngoài ra enzyme chitinase còn có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học.

Khả năng khử chitin làm cho chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm MT.

Chitinase được khai thác sử dụng như là tác nhân phòng trừ sinh học. Chúng cũng có vai trò quan trọng

trong sự hình thành thể nguyên sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất các chitooligosaccharid hoạt hóa.

Trong vitro những thí nghiệm thử HT kháng nấm bằng cách sử dụng Trichderma harzianum đã làm

phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides.

Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn một số chủng NS từ RNM Cần

Giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao”

Mục tiêu của đề tài:

Góp phần tìm hiểu đặc điểm và vai trò của enzyme chitinase từ các chủng NS có nguồn gốc từ

RNM Cần Giờ làm cơ sở cho việc ứng dụng trong thực tiễn

Nhiệm vụ của đề tài

1. Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có

trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM. Chọn ra 2 chủng có khả

năng sinh enzyme chitinase cao

2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài 2 chủng thu được