Thiết lập và tối ưu hóa các quy trình xác định Marker phân tử trên 10 giống dưa leo địa phương và nhập nội (Cucurmis sativus L.) / Lê Thị Kính

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

THIẾT LẬP VÀ TỐI ƯU HÓA

CÁC QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ

TRÊN 10 GIỐNG DƯA LEO ĐỊA PHƯƠNG VÀ

NHẬP NỘI (Cucumis sativus L.)

Mã số: T984-09-01

Chủ nhiệm đề tài: TS LÊ THỊ KÍNH

TP.HỒ CHÍ MINH, 8/2014

THIẾT LẬP VÀ TỐI ƯU HÓA CÁC QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ TRÊN 10 GIỐNG

DƯA LEO ĐỊA PHƯƠNG VÀ NHẬP NỘI( Cucumis sativus L.)

Lê Thị Kính và cộng sự

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Trang i

MỤC LỤC

Trang

I. MỞ ĐẦU

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ DƯA LEO 1

1.1. Tầm quan trọng của dưa leo 1

1.2. Tình hình canh tác và cơ cấu giống dưa leo ở Việt Nam 2

2. ỨNG DỤNG MARKER PROTEIN/ISOZYME TRONG NGHIÊN CỨU

ĐA DẠNG DI TRUYỀN 3

2.1. Kỹ thuật điện di Isozyme 3

2.2. Ứng dụng marker Protein/Isozyme trong nghiên cứu di truyền dưa leo 4

3. ỨNG DỤNG MARKER RAPD TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN

VÀ CẢI THIỆN GIỐNG DƯA LEO 6

3.1 Kỹ thuật RAPD-PCR 7

3.2. Ứng dụng marker RAPD – PCR trong nghiên cứu về di truyền và chọn giống

dưa leo 8

4. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 12

5. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 12

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14

1.1. Vật liệu thực vật 14

1.2. Hóa chất dụng cụ 14

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1. Kỹ thuật điện di đẳng điện (IEF: Isoelectric focussing) 16

2.2. Phân tích RAPD-PCR 18

2.2.1. Ly trích DNA 18

THIẾT LẬP VÀ TỐI ƯU HÓA CÁC QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ TRÊN 10 GIỐNG

DƯA LEO ĐỊA PHƯƠNG VÀ NHẬP NỘI( Cucumis sativus L.)

Lê Thị Kính và cộng sự

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Trang ii

2.2.2. Qui trình thực hiện phản ứng RAPD-PCR 20

2.2.3. Điện di sản phẩm PCR 20

3. THU THẬP XỬ LÝ SỐ LIỆU 20

III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

1. KHẢO SÁT MARKER ISOZYME 21

1.1. Thiết lập quy trình xác định marker Isozyme bằng kỹ thuật điện di

đẳng điện (IEF) 21

1.2. Khảo sát đa hình isozyme trên 10 giống dưa leo 25

2. TỐI ƯU QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH MARKER RAPD-PCR 27

2.1. Lựa chọn mô ly trích DNA 27

2.2. Tối ưu qui trình ly trích DNA 27

2.3. Tối ưu qui trình phản ứng RAPD-PCR 30

3. PHÂN TÍCH ĐA HÌNH RAPD TRÊN 10 GIỐNG DƯA LEO 34

3.1. Độ thuần của các giống dưa leo khảo sát 34

3.2. Phân tích tính đa hình của marker RAPD trên 10 giống dưa leo 35

4. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRÊN 10 GIỐNG DƯA LEO DỰA

TRÊN MARKER RAPD VÀ PROTEIN/ISOZYME 39

IV. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

1. KẾT LUẬN 43

2. ĐỀ NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

THIẾT LẬP VÀ TỐI ƯU HÓA CÁC QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ TRÊN 10 GIỐNG

DƯA LEO ĐỊA PHƯƠNG VÀ NHẬP NỘI( Cucumis sativus L.)

Lê Thị Kính và cộng sự

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Trang iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTPs: Deoxynucleoside triphosphate

bp: Base pair (cặp base)

Taq: Thermus aquaticus

TBE: Tris – bazo – EDTA

TE: Tris – EDTA

UV: Ultraviolet (tử ngoại)

EtBt: Ethidium Bromide

L: Ladder (thang chuẩn)

RAPD: Random Amplified Polymophism DNA

PCR: Polymerase Chain Reaction

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms

AFLP: Amplified Fragments Length Polymorphism

SSR: Simple Sequence Repeat

CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide

NTSYS: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System

UPGMA: Unweighted pair group methods with arithmetic

IEF: Isoelectric focussing

TP: Total Protein

EST: Esterase

THIẾT LẬP VÀ TỐI ƯU HÓA CÁC QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ TRÊN 10 GIỐNG

DƯA LEO ĐỊA PHƯƠNG VÀ NHẬP NỘI( Cucumis sativus L.)

Lê Thị Kính và cộng sự

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Trang iv

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1: Tình hình sản xuất dưa leo của một số nước trên thế giới qua các năm

2008, 2009 1

Bảng 2: Danh sách 10 giống dưa aleo khảo sát 14

Bảng 3: Danh sách 14 mồi RAPD sử dụng cho phản ứng RAPD-PCR 15

Bảng 4: Công thức đổ gel 16

Bảng 5: Các giai đoạn chạy điện di IEF trên gel 16

Bảng 6: Qui trình nhuộm protein tổng số 17

Bảng 7: Công thức nhuộm Esterase (EST) 17

Bảng 8: Dung dịch CTAB biến đổi (li trích DNA) 18

Bảng 9: Kết quả thí nghiệm về loại dịch ly trích và mô ly trích 22

Bảng 10: Kết quả thí nghiệm về các biên độ pH khác nhau của các hệ Enzyme 23

Bảng 11: Kết quả đa hình Isozyme 26

Bảng 12: Kết quả đo OD trên DNA từ lá thực (quy trình 1) 28

Bảng 13: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp và nồng độ MgCl2 trên mồi OPA-11 31

Bảng 14: Danh sách các mồi RAPD cho băng đa hình trên 10 giống dưa leo 36

Bảng 15: Hệ số tương đồng Nei dựa trên marker RAPD và protein/isozyme giữa

10 giống dưa leo 40

Bảng 16: Phân nhóm khoảng cách di truyền của 10 giống dưa leo khảo sát 41