Tài liệu Luận văn cao học “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1

TRƯỜNG ……………….

KHOA………………..

----------

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP

Đề tài:

Thiết kế vector mang gen

HA1 mã hóa protein bề

mặt của virus H5N1

1

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………...i

LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………ii

MỤC LỤC …………………………………………………………………iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ……………………………………………vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ………………………………………………..vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………………..viii

MỞ ĐẦU ...................................................... Error: Reference source not found

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3

1.1. Cúm A/H5N1 .......................................................................................... 3

1.1.1. Cấu tạo .............................................................................................. 3

1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ ................................................... 5

1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 .................................... 7

1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A

trong tế bào vật chủ ......................................................................... 8

1.2. Kháng nguyên HA ................................................................................ 10

1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu

vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới ............................ 12

1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1

ở Việt Nam và trên thế giới.. ..... 1 Error: Reference source not found

1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1

ở Việt Nam và trên thế giới ................................................................ 16

1.4. Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng ................ 19

1.4.1. Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens .................................................... 19

1.4.2. Hệ vector nhị thể ........................ Error: Reference source not found1

2

1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học

tái tổ hợp ..................................... Error: Reference source not found3

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ Error:

Reference source not found5

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ......... Error: Reference source not found5

2.1.1. Vật liệu ........................................ Error: Reference source not found5

2.1.2. Hóa chất ...................................... Error: Reference source not found5

2.1.3. Thiết bị ........................................ Error: Reference source not found6

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............... Error: Reference source not found6

2.2.1. Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR ............. Error:

Reference source not found6

2.2.2. Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal ....... Error:

Reference source not found8

2.2.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến

E. coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt .................................. 30

2.2.4. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway .... 3 Error: Reference

source not found

2.2.5. Biến nạp vector chuyển gen vào A. rhizogenes ATCC15834 .......... 35

2.2.6. Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc lá

thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 .............................. 36

2.2.7. Phương pháp đánh giá cây trồng chuyển gen .............................. 37

2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ………………………………………. 39

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 40

3.1. Kết quả tách dòng gen HA1 ................................................................ 40

3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen HA1 ................................................. 40

3.1.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................. 41

3

3.1.3. Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal. 4 Error: Reference

source not found

3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 bằng kỹ thuật Gateway ®

. 47

3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR ....................................... 47

3.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR . 48

3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn ........... 48

3.3. Kết quả biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes . . 49

3.4. Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes

sử dụng gen chỉ thị Gus ....................................................................... 51

3.5. Kết quả chuyển gen HA1 vào mảnh lá thông qua A. rhizogens

để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen HA1 ............................................... 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 57

PHỤ LỤC …………………………………………………………………. 66

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các

loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm

virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim

mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy

hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là nơi

cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới. Các

subtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể

và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trước

đây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái

4

hiện và gây nên đại dịch mới. Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại các

nước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, Nam

Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3

(Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm

chết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan. Chủng H5N1 điển hình ở

châu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng

A/Vietnam/1203/04.

Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàng

năm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trăm

triệu con gà vịt. Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếm

những công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao.

Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được

các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là

hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức

khoẻ cộng đồng như Việt Nam.

Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các

cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong

những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng

được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy

sinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Do tế bào thực

vật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng

sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng

hơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người.

Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm

A/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương

pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế

5

vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu

chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”.

2. Mục tiêu của đề tài

- Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein

vỏ của virus H5N1.

- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây

thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens.

3. Nội dung nghiên cứu

- Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào

vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp.

- Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của

virus H5N1.

- Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein

vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A. rhizogens.

- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây

thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cúm A/H5N1

1.1.1. Cấu tạo

Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính

của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra.

Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân

type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt vỏ của hạt

virus . Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện,

đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử

khoảng 250 triệu Dal. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa

6

khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là

carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc

ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand (Hình

1).

Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức

hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A. Ghi chú: A: Các dạng

hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình

cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA,

Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị

phức hợp enzyme polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp

ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology,

University of Cambridge).

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của

virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào

nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có

khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng

10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ

virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các

7