Tài liệu Chương 10:Đại cương về Công nghệ DNA Tái tổ hợp ppt

258

Chương 10

Đại cương về Công nghệ DNA Tái tổ hợp

Việc tinh chế enzyme cắt giới hạn đầu tiên (1970) và sử dụng nó để

tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên trong ống nghiệm (1972-1973)

là nền tảng cho sự ra đời của kỹ thuật di truyền (genetic engineering) và

công nghệ DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology). Chính sự phát

triển nhanh chóng của lĩnh vực này không những đã đưa lại khối lượng tri

thức khổng lồ về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các gene, các bộ gene

prokaryote và eukaryote mà còn trở thành lực lượng sản xuất trực tiếp của

xã hội: tạo ra hàng loạt các chế phẩm y-sinh học hữu ích từ các tế bào vi

khuẩn, nấm men; tạo các giống sinh vật mới... góp phần giải quyết những

vấn đề thực tiễn đặt ra trong y học và trong công tác chọn tạo giống.

Trong chương này chúng ta sẽ tìm hiểu các đặc tính của enzyme cắt

giới hạn, các nguyên lý cơ bản của kỹ thuật DNA tái tổ hợp và một số ứng

dụng của lĩnh vực công nghệ này.

I. Các công cụ chính của kỹ thuật tạo dòng DNA tái tổ hợp

1. Các enzyme cắt giới hạn

1.1. Enzyme cắt giới hạn là gì?

Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme

giới hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự

nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung

tại các vị trí đặc thù.

1.2. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn

Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi

khuẩn E. coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được

đưa vào, gọi là DNA ngoại lai hay DNA lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và

hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số ít

trường hợp DNA lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bản

trong tế bào chủ. Điều đó chứng tỏ DNA lạ được sửa đổi bằng cách nào đó

dưới sự kiếm soát của tế bào chủ. Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếu

khi các thể thực khuẩn (phage) xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn.

Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi

khuẩn là những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và

các enzyme cắt giới hạn. Chúng đều có đối tượng nhận biết là các đoạn

trình tự của DNA vật chủ và DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau.

Cụ thể, các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ

259

bằng cách gắn thêm nhóm methyl (-CH3) ở một số base nhất định trong

đoạn nhận biết (recognition sequence) hay đoạn đích (target sequence).

Hiện tượng methyl hoá (methylation) này thường xảy ra đối với adenine

và biến đổi nó thành N-6 methyladenine. Trong khi đó, các enzyme giới

hạn lại đóng vai trò vô hiệu hoá hoạt tính di truyền của các DNA lạ bằng

cách phân cắt ở các vị trí đặc thù chừng nào nó chưa được sửa đổi cho

giống với DNA vật chủ. Như vậy, các enzyme giới hạn đóng vai trò là

hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm nhập

của các phage lạ.

1.3. Tính chất chung của các enzyme giới hạn

Trước tiên, cần lưu ý rằng các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở các

vi khuẩn mà không có ở các eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzyme

giới hạn thông dụng là tên hệ thống, được biểu thị bằng ba hoặc bốn chữ

cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme được chiết xuất. Chữ cái đầu

tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái tiếp theo viết thường

để chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để chỉ nòi hoặc

chủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các enzyme cùng một nòi

người ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống (xem bảng 10.1).

các đoạn DNA nối

ở các đầu dính

đầu dính

đầu dính

DNA tái tổ hợp

+ DNA ligase

Hình 10.1 Enzyme giới hạn (EcoRI) cắt các DNA khác nhau, nhờ đó có thể

kiến tạo phân tử DNA tái tổ hợp in vitro (bắng enzyme DNA ligase).

Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị

trí, nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị

trí xác định. Tuỳ theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại: