Sàng lọc vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây lúa vùng ngập mặn có kích hoạt tính kích thích tăng trưởng cây trồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH



BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài

SÀNG LỌC VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ NỘI

SINH CÂY LÚA VÙNG NGẬP MẶN CÓ

HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG

CÂY TRỒNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA

MSSV: 1153010264

KHÓA: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự cố gắng của bản thân còn có sự hƣớng

dẫn của thầy cô, anh chị và sự giúp đỡ của bạn bè.

Đầu tiên, con cảm ơn ba mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, tạo mọi điều

kiện tốt nhất để con hoàn thành tốt việc học của mình.

Em xin chân thành cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Trƣờng

Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức nền tảng vô

cùng quý giá, tạo tiền đề để em tiếp tục học tập, nghiên cứu. Em xin lời gửi cảm ơn

chân thành đền thầy Nguyễn Văn Minh và cô Dƣơng Nhật Linh luôn ở bên cạnh

định hƣớng, truyền đạt kinh nghiệm, động viên em hoàn thành đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn chị Võ Thị Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh,

anh Hà Chế Linh và các anh, chị, các bạn và các em ở phòng thí nghiệm Vi sinh đã

ủng hộ và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Cuối cùng, em xin gửi đến tất cả các thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn và

kích chúc sức khỏe, may mắn và gặt hái nhiều thành công trong tƣơng lai.

Em xin chân thành cảm ơn.

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN BÍCH HOA

DANH MỤC

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA i

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Diện tích gieo trồng lúa cả nƣớc (nghìn ha)...............................................6

Bảng 1.2. Năng suất lúa cả nƣớc (tạ/ha) .....................................................................6

Bảng 1.3. Phân loại đất mặn........................................................................................9

Bảng 2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn phospho ..............................................................31

Bảng 2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn IAA ....................................................................34

Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể của các chủng đƣợc phân lập........................................49

Bảng 3.2. Đặc điểm vi thể của các chủng phân lập ..................................................53

Bảng 3.3. Số chủng phân lập đƣợc từ các mẫu .........................................................58

Bảng 3.4. Khả năng chịu mặn của vi khuẩn ở các nồng độ muối khảo sát...............58

Bảng 3.5. Kết quả định lƣợng P2O5 của các chủng...................................................64

Bảng 3.6. Kết quả định lƣợng sinh IAA của các chủng............................................66

Bảng 3.7. Bảng tóm tắt các chủng có hoạt tính kích thích tăng trƣởng thực vật......70

Bảng 3.8. Kết quả định danh sinh hóa của vi khuẩn thuộc nhóm Azotobacter ........73

Bảng 3.9. Kết quả định danh sinh hóa của vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus...............74

Bảng 3.10. Kết quả chiều dài rễ, thân lúa, trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô.........78

DANH MỤC

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA ii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình thái Azotobacter trên môi trƣờng vô đạm (A) và tế bào vi khuẩn

dƣới kính hiển vi (B) (http://inst.bact.wisc.edu).......................................................23

Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể của các chủng đƣợc phân lập........................................49

Hình 3.1. Hình đại thể của một số chủng vi khuẩn trên môi trƣờng NA..................53

Bảng 3.2. Đặc điểm vi thể của các chủng phân lập ..................................................53

Hình 3.2. Hình ảnh quan sát vi thể một số chủng phân lập đƣợc (X100).................57

Hình 3.3. Khả năng cố định nitơ phân tử trên môi trƣờng vô đạm Asbhy của chủng

TĐ9 và TĐ1 ..............................................................................................................63

Hình 3.4. Khả năng hòa tan lân của vi khuẩn trên môi trƣờng Pikovskaya của chủng

TĐ13 và LĐ2 ............................................................................................................64

Hình 3.5. Kết quả thử khả năng tƣơng thích giữa các chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn.

...................................................................................................................................75

Hình 3.6. Hạt lúa nảy mầm trên đĩa agar ..................................................................76

Hình 3.7. Hạt lúa nảy mầm đƣợc ngâm trong dịch khuẩn tƣơng ứng với từng

nghiệm thức...............................................................................................................77

Hình 3.8. Giai đoạn lúa phát triển đƣợc 3 ngày và 7 ngày sau khi gieo ...................77

Hình 3.9. Chiều dài rễ giữa các nghiệm thức............................................................81

Hình 3.10. Chiều dài thân giữa các nghiệm thức......................................................81

DANH MỤC

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Bố trí thí nghiệm......................................................................................28

Sơ đồ 2.2. Quy trình định lƣợng phospho.................................................................32

Sơ đồ 2.3. Quy trình định lƣợng IAA .......................................................................35

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biều đồ 3.1. Đồ thị biểu diễn nồng độ phospho tan trong dịch nuôi cấy các chủng.65

Biểu đồ 3.2. Đồ thị biểu diễn nồng độ IAA trong dịch nuôi cấy các chủng.............68

Biểu đồ 3.3 Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ của các nghiệm thức................................79

Biểu đồ 3.4. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân của các nghiệm thức...........................79

Biểu đồ 3.5. Đồ thị biểu diễn trọng lƣợng tƣơi của các nghiệm thức.......................80

Biểu đồ 3.6. Đồ thị biểu diễn trọng lƣợng khô của các nghiệm thức .......................80

DANH MỤC

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CFU Colony Forming Unit

Đđ Đậm đặc

H Giờ

IAA Indole Acetic Acid

MS Minimal Salt

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

OD Optical Density

ppm Parts per milion

TSA Tryticase Soy Agar

TSB Tryticase Soy Broth

DANH MỤC

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA v

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4

1.1. GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ CÂY LÚA........................................................5

1.1.1 Sơ lƣợc về cây lúa .......................................................................................5

1.1.2 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới......................................................5

1.1.3 Tình hình sản xuất lúa gạo trong nƣớc........................................................6

1.2. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ MẶN ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT

TRIỂN CỦA THỰC VẬT ..........................................................................................7

1.2.1 Sơ lƣợc về đất mặn......................................................................................7

1.2.2 Các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam.........................................................8

1.2.3 Tác hại của mặn đến cây trồng..................................................................10

1.2.4 Tính chống chịu mặn của cây lúa..............................................................11

1.3. VI SINH VẬT VÙNG RỄ ............................................................................12

1.3.1 Sơ lƣợc vi khuẩn vùng rễ ..........................................................................12

1.3.2. Các nghiên cứu trên thế giới .................................................................13

1.3.3. Các nghiên cứu trong nƣớc ...................................................................13

1.4. VI KHUẨN NỘI SINH.................................................................................13

1.4.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn nội sinh.....................................................................13

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................................14

1.4.3 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc..............................................................15

1.5. SỰ CỐ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ CỦA VI KHUẨN.....................................15

1.5.1 Quá trình cố định nitơ phân tử ..................................................................15

1.5.2 Cơ chế cố định nitơ phân tử ......................................................................15

1.6. VI KHUẨN HÒA TAN LÂN.......................................................................16

1.6.1 Vai trò của lân đối với cây trồng...............................................................16

1.6.2 Vi sinh vật hòa tan lân hữu cơ...................................................................17

1.6.3 Vi sinh vật hòa tan lân vô cơ.....................................................................17

1.7. VI KHUẨN SINH IAA.................................................................................18

1.8. VI KHUẨN BACILLUS................................................................................19

DANH MỤC

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA vi

1.9. VI KHUẨN AZOTOBACTER.......................................................................20

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................24

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU..............................................25

2.2. VẬT LIỆU ....................................................................................................25

2.3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƢỜNG ......................................................25

2.3.1. Thiết bị ..................................................................................................25

2.3.2. Môi trƣờng – hóa chất...........................................................................26

2.3.3. Thuốc thử ..............................................................................................26

2.4. PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN....................................................................28

2.4.1. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................28

2.4.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn chịu mặn ............................................29

2.5. ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA VI KHUẨN..................30

2.6. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN.................................................30

2.6.1. Nguyên tắc ............................................................................................30

2.6.2. Định tính khả năng hòa tan lân .............................................................31

2.6.3. Định lƣợng khả năng hòa tan lân ..........................................................31

2.7. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH IAA...........................................................33

2.7.1. Nguyên tắc ............................................................................................33

2.7.2. Định lƣợng IAA trong dịch nuôi cấy vi khuẩn .....................................33

2.8. ĐỊNH DANH ................................................................................................36

2.9. THÍ NGHIỆM THỬ KHẢ NĂNG TƢƠNG THÍCH GIỮA CÁC CHỦNG

ĐƢỢC LỰA CHỌN .................................................................................................45

2.9.1. Nguyên tắc ............................................................................................45

2.9.2. Cách tiến hành.......................................................................................45

2.10. THÍ NGHIỆM TRỒNG LÚA.......................................................................45

2.10.1. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................45

2.10.2. Đánh giá một số đặc tính nông học của cây lúa....................................46

2.11. PHƢƠNG PHÁP THỐNG KÊ SỐ LIỆU.....................................................47

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................48

3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP.................................................................................49

DANH MỤC

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA vii

3.1.1. Kết quả quan sát đại thể ........................................................................49

3.1.2. Kết quả quan sát vi thể ..........................................................................53

3.2. KHẢ NĂNG CHỊU MẶN CỦA VI KHUẨN ..............................................58

3.3. KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM NITƠ PHÂN TỬ.........................................63

3.4. KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN .....................................................................63

3.4.1. Định tính khả năng hòa tan lân .............................................................63

3.4.2. Định lƣợng khả năng phân giải lân của các chủng ...............................64

3.5. KHẢ NĂNG SINH IAA...............................................................................66

3.6. TÓM TẮT CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH TĂNG

TRƢỞNG THỰC VẬT.............................................................................................70

3.7. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH..............................................................................72

3.7.1. Kết quả định danh sơ bộ........................................................................72

3.7.2. Kết quả định danh chủng thuộc chi Azotobacter..................................73

3.7.3. Kết quả định danh chủng thuộc chi Bacillus ........................................73

3.8. KẾT QUẢ THỬ KHẢ NĂNG TƢƠNG THÍCH GIỮA CÁC CHỦNG VI

KHUẨN ĐƢỢC LỰA CHỌN..................................................................................75

3.9. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG

CỦA CÁC CHỦNG THỬ NGHIỆM TRÊN MÔ HÌNH TRỒNG LÚA .................75

3.9.1. Chọn giống, ƣơm hạt giống nảy mầm, tiến hành trồng lúa ..................75

3.9.2. Kết quả một số đăc tính nông học.........................................................78

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................85

4.1 KẾT LUẬN...................................................................................................86

4.2 ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................86

TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................87

PHỤ LỤC ................................................................................................................96

ĐẶT VẤN ĐỀ

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

ĐẶT VẤN ĐỀ

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 2

Lúa (Oryza sativa L.) thuộc họ Hòa Bản là cây ngũ cốc quan trọng nhất

trong sự phát triển thế giới và là lƣơng thực chính của hơn một nửa dân số thế giới

(FAOSTAT: http://faostat3.fao.org). Trên thế giới cây lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ

hai sau cây lúa mì về diện tích và sản lƣợng. Ở châu Á, lúa gạo đƣợc coi là cây

lƣơng thực quan trọng nhất, chiếm diện tích 135 triệu ha trong tổng số 148,4 triệu

ha trồng lúa của toàn thế giới. Theo FAOSTAT, tổng sản lƣợng lúa gạo năm 2013

của Việt Nam là 232.176.196 tấn (FAOSTAT:http://faostat3.fao.org). Trong tƣơng

lai, xu thế sử dụng lúa gạo sẽ tiếp tục tăng hơn nữa vì đây là loại lƣơng thực dễ bảo

quản, dễ chế biến và cho năng lƣợng khá cao. Theo tính toán của Peng và cộng sự

(1999), đến năm 2030 sản lƣợng lúa của thế giới phải đạt 800 triệu tấn mới có thể

đáp ứng đƣợc nhu cầu lƣơng thực của con ngƣời.Với tình trạng khan hiếm và giá

ngày càng tăng nhƣ hiện nay, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lƣơng thực.

Theo một nghiên cứu của Lobell, đến năm 2030 sản lƣợng lƣơng thực ở châu Á sẽ

giảm 10 % hoặc hơn, đặc biệt là sản phẩm lúa gạo (Lobell và cộng sự., 2008).

Nguyên nhân làm giảm năng suất và sản lƣợng lúa là do ảnh hƣởng của thiên tai,

sâu bệnh và các yếu tố môi trƣờng. Trong đó, đáng chú ý là hiện tƣợng đất nhiễm

mặn. Diện tích đất trồng trọt bị ảnh hƣởng mặn ƣớc khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3

đất trồng trên toàn thế giới (Bùi Chí Bửu và cộng sự., 2003).

Việt Nam với đƣờng bờ biển dài 3.620 km trải dọc từ Bắc vào Nam, hàng

năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hƣởng rất nhiều do sự xâm thực của

biển (Hoàng Ngọc Giao, 2002). Theo thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là

494.000 ha, đến năm 2000 là 606.792 ha (Nguyễn Ngọc Anh, 2005). Theo báo cáo

mới nhất của Cục trồng trọt, tại đồng bằng sông Cửu Long, xâm ngập mặn đã ảnh

hƣởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông xuân 2009 − 2010, chiếm 40 % diện

tích toàn vùng. Trong đó, diện tích có nguy cơ bị xâm ngập mặn cao khoảng

100.000 ha/ 650.000 ha, chiếm 16 % diện tích canh tác lúa của các tỉnh trên. Đặc

biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tƣợng băng tan ở hai cực,

nƣớc biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven biển. Nhƣ vậy, đất nhiễm

mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lƣợc phát triển sản

lƣợng lúa gạo, và ảnh hƣởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lƣơng thực sẽ khó

ĐẶT VẤN ĐỀ

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 3

hoàn thành. Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất

lúa gạo là một vấn đề cần đƣợc quan tâm nghiên cứu.

Có nhiều phƣơng pháp để tăng năng suất trong đó có biện pháp sử dụng hóa

chất nông nghiệp. Tuy nhiên phƣơng pháp hóa học có nhiều nhƣợc điểm nhƣ dẫn

đến sự suy thoái đất và xuất hiện nhiều đột biến (Houdart và cộng sự., 2009) gây ô

nhiễm môi trƣờng và điều quan trọng là ảnh hƣởng đến thu nhập của ngƣời nông

dân. Giải pháp tốt nhất để giải quyết vấn đề trên là sử dụng vi khuẩn chịu mặn có

khả năng phát triển tốt ở vùng đất mặn và có hoạt tính kích thích tăng trƣởng

(Mayak và cộng sự., 2004).

Một số nghiên cứu cho thấy rằng, vi khuẩn chịu mặn đƣợc phân lập từ vùng

đất xung quanh rễ có khả năng sản xuất IAA, HCN, lipase hoặc protease và thúc

đẩy tăng trƣởng bằng khả năng cố định nitơ tự do, hòa tan lân, sinh hormon IAA

(Egamberdieva và cộng sự, 2008; Lazarovits và cộng sự, 1997). Một nghiên cứu

cho thấy rằng các Poly-β-Hydroxybutyrate (PHB) và Glycogen do vi khuẩn nội sinh

tiết ra ảnh hƣởng đến độ phì nhiêu của đất, cải thiện tăng trƣởng và năng suất cây

trồng trên vùng đất nhiễm mặn (Ali và cộng sự., 2014).

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:“Sàng lọc vi khuẩn vùng rễ và nội sinh

cây lúa vùng ngập mặn có hoạt tính kích thích tăng trƣởng cây trồng”. Với mục

tiêu nhằm phân lập vi khuẩn chịu mặn ở vùng rễ, nƣớc và nội sinh của cây lúa có

hoạt tính kích thích tăng trƣởng cây trồng.

Nội dung thực hiện: bao gồm

 Phân lập vi khuẩn vùng rễ, nƣớc và nội sinh ở cây lúa.

 Sàng lọc vi khuẩn có khả năng chịu mặn ở cây lúa.

 Xác định hoạt tính cố định nitơ phân tử, hòa tan lân, sinh IAA của những

chủng phân lập đƣợc.

 Định danh chủng có hoạt tính cao.

 Thí nghiệm trên mô hình trồng lúa.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 4

PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI

LIỆU