Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol / Dương Nhật Linh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT

TÍNH GIẢM CHOLESTEROL

Mã số: T2012.22.151

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Dương Nhật Linh

TP. HCM, 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT

TÍNH GIẢM CHOLESTEROL

Mã số: T2012.22.151

Thành viên đề tài: ThS. Dương Nhật Linh

ThS. Nguyễn Văn Minh

CN. Đan Duy Pháp

CN. Lê Thị Anh Thiện

CN. Phạm Thị Minh Trang

TP. HCM, 11 /2014

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI

Chủ nhiệm:

Thành viên:

ThS. Dương Nhật Linh

ThS. Nguyễn Văn Minh

Đan Duy Pháp

Lê Thị Anh Thiện

Phạm Thị Minh Trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

__________________

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol.

- Mã số: T2012.22.151

- Chủ nhiệm đề tài: Dương Nhật Linh

- Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Trường ĐH. Mở Tp. HCM.

- Thời gian thực hiện: 12/2012 - 02/2014

2. Mục tiêu: Sàng lọc được chủng vi khuẩn Lactic có đồng thời hoạt tính probiotic và

giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm.

3. Tính mới và sáng tạo:

- Hiệu quả giảm cholesterol của các chủng vi khuẩn lactic được nghiên cứu cả in

vitro và in vivo. Ở Việt Nam, đây là hướng nghiên cứu mới và chưa có bài báo

khoa học về thử nghiệm hiệu quả giảm cholesterol trên mô hình chuột được

công bố.

- Chúng tôi đã sàng lọc đồng thời hoạt tính probiotic và hiệu quả giảm

cholesterol của các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Kết quả của đề tài là tiền đề để

nghiên cứu sản xuất probiotic.

4. Kết quả nghiên cứu:

- Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện thử nghiệm đồng thời hoạt tính

probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm của 39 chủng vi

khuẩn lactic và thu được 3 chủng L. plantarum NT1.5, L. Plantarum E16.2, L.

paracasei/casei YK1.1 đáp ứng được 2 tiêu chí trên. Cả 3 chủng YK1.1,

NT1.5, E16.2 có khả năng giảm cholesterol lần lượt 22,46% (giảm từ 3,65

mmol/L xuống 2,83 mmol/L), 22,96% (3,44 mmol/ L xuống 2,65 mmol/ L) và

20% (3,75 mmol/ L xuống 3,00 mmol/ L) ở 120 ngày thử nghiệm.

5. Sản phẩm:

- Chủng vi khuẩn L. plantarum NT1.5, L. plantarum E16.2, L. paracasei/casei

YK1.1 vừa có hoạt tính probiotic và khả năng giảm cholesterol in vitro, in

vivo.

- Đào tạo được 03 cử nhân công nghệ sinh học.

o Lê Thị Anh Thiện MSSV: 0853 010 867

 Đề tài: Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm

cholesterol từ sữa mẹ và phân em bé.

o Phạm Trần Phương Dung MSSV: 0853 010 111

 Đề tài: Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm

cholesterol từ thực phẩm lên men.

o Phạm Thị Minh Trang MSSV: 0953 010 758

 Đề tài: “Thử nghiệm hiệu quả chủng vi khuẩn lactic có đồng thời

hoạt tính Probiotic và giảm cholesterol trên mô hình chuột thí

nghiệm”.

- Có 02 bài báo khoa học được đăng trên tạp chí chuyên ngành:

o Nguyễn Văn Thái, Vương Văn Sơn, Dương Nhật Linh, Trần Cát Đông,

2012, Khảo sát tính khử liên hợp muối mật và khả năng làm giảm

cholesterol của một số chủng Lactobacillus, Y học TPHCM, tập 16

(phụ bản 1), pp.254-259.

o Dương Nhật Linh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương Dung, Phạm

Thị Minh Trang, Nguyễn Văn Minh, Trần Cát Đông, 2013, Sàng lọc vi

khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol. Hội Nghị CNSH Toàn quốc

KV Phía nam, Tạp chí sinh học 36 (1se), 47-53.

6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

- Viết một số bài báo đăng trên tạp chí về công nghệ sinh học, y dược nhằm

thông tin các kết quả nghiên cứu.

- Chuyển giao kết quả nghiên cứu cho các đơn vị sản xuất chế phẩm về khả năng

giảm cholesterol.

Cơ quan chủ trì xác nhận

KT. HIỆU TRƯỞNG

PHÓ HIỆU TRƯỞNG

Ngày tháng năm

Chủ nhiệm đề tài

(Ký, Họ và tên)

i

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC .......................................................................... 4

1.1.1. Khái niệm........................................................................................................... 4

1.1.2. Quá trình chuyển hóa và tác dụng của probiotic .................................................. 4

1.1.3. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic ....................................................................... 5

1.1.4. Tình hình nghiên cứu probiotic trong và ngoài nước ........................................... 7

1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC........................................................... 10

1.3. TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL................................................................. 13

1.3.1. Giới thiệu ......................................................................................................... 13

1.3.2. Chức năng ........................................................................................................ 13

1.3.3. Phân loại........................................................................................................... 14

1.3.4. Tổng hợp cholesterol ........................................................................................ 15

1.3.5. Cơ chế điều hòa lượng cholesterol trong máu.................................................... 16

1.3.6. Bài tiết.............................................................................................................. 17

1.3.7. Chuyển hóa bởi vi sinh vật................................................................................ 18

1.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI SINH VẬT ................................................ 18

1.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống...................................... 18

1.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự ............................................... 19

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................... 22

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.................................................... 23

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 23

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 23

2.2.2. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm........................................................................ 23

2.2.3. Môi trường – hóa chất....................................................................................... 24

2.2.4. Thuốc thử - thuốc nhuộm.................................................................................. 24

2.2.5. Dụng cụ............................................................................................................ 25

2.2.6. Trang thiết bị .................................................................................................... 25

2.3. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM........................................................................................ 26

2.3.1. Tái phân lập...................................................................................................... 26

2.3.2. Sàng lọc các chủng có khả năng hấp thu cholesterol của tế bào vi khuẩn từ môi

trường nuôi cấy ................................................................................................................

......................................................................................................................... 27

2.3.3. Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym BSH..................................... 28

2.3.4. Thử khả năng sinh enzym ngoại bào ................................................................. 32

2.3.5. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ........................................................................ 34

2.3.6. Khả năng chịu pH dạ dày.................................................................................. 35

2.3.7. Khả năng chịu mật............................................................................................ 36

2.3.8. Thử khả năng nhạy cảm với kháng sinh (MIC) ................................................. 37

2.3.9. Kiểm tra khả năng huyết giải ............................................................................ 38

2.3.10. Định danh bằng phương pháp truyền thống(Martin D. & cs., 2006).............. 39

2.3.11. Định danh bằng kỹ thuật giải trình tự ............................................................ 41

2.3.12. Xây dựng mô hình gây tăng cholesterol trên chuột ....................................... 45

2.3.13. Khảo sát khả năng giảm cholesterol .............................................................. 47

ii

2.3.14. Khảo sát một số hoạt tính probiotic trên mô hình chuột................................. 48

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................... 50

3.1. KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP............................................................................... 51

3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL TRONG MÔI

TRƯỜNG NUÔI CẤY................................................................................................... 51

3.2.1. Xây dựng đồ thị đường chuẩn ........................................................................... 51

3.2.2. Khả năng giảm cholesterol trong môi trường MRS ........................................... 52

3.3. ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG SINH ENZYME BSH ............................................. 58

3.4. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME BSH........................................................ 61

3.4.1. Xây dựng đồ thị chuẩn...................................................................................... 61

3.4.2. Kết quả xác định hoạt độ chung và hoạt độ riêng enzyme BSH của các chủng

khảo sát........................................................................................................................ 64

3.5. KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO....................................................... 68

3.6. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN........................................................................ 71

3.7. KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI MẬT....................................................................... 75

3.8. KHẢ NĂNG CHỊU PH DẠ DÀY....................................................................... 78

3.9. KIỂM TRA KHẢ NĂNG HUYẾT GIẢI........................................................... 80

3.10. THỬ NGHIỆM NHẠY/ KHÁNG KHÁNG SINH ............................................ 81

3.11. TÓM TẮT KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỒNG THỜI HOẠT TÍNH PROBIOTIC

VÀ KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA 9 CHỦNG THỬ NGHIỆM ............ 84

3.12. ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG ............................ 87

3.12.1. Kết quả phân nhóm vi khuẩn lên men đồng hình – dị hình ............................ 87

3.12.2. Định danh bằng phương pháp truyền thống ................................................... 88

3.13. ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ...................... 89

3.13.1. Tách chiết, PCR và tinh sạch sản phẩm 16S rDNA ....................................... 89

3.13.2. Kết quả hiệu chỉnh trình tự............................................................................ 90

3.13.3. So sánh trình tự trên cơ sở dữ liệu Genbank .................................................. 91

3.14. KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH TĂNG CHOLESTEROL TRÊN CHUỘT

91

3.15. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM GIẢM CHOLESTEROL TRÊN MÔ HÌNH

CHUỘT .......................................................................................................................... 94

3.15.1. Kết quả gây tăng cholesterol bằng chế độ ăn ................................................. 94

3.15.2. Kết quả thử nghiệm hiệu quả giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm ..

..................................................................................................................... 95

3.16. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH PROBIOTIC TRÊN MÔ

HÌNH CHUỘT............................................................................................................... 99

3.16.1. Trọng lượng của chuột trong thời gian thí nghiệm......................................... 99

3.16.2. Kết quả đo sức khỏe tổng quát .................................................................... 101

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 102

4.1. KẾT LUẬN....................................................................................................... 103

4.2. KIẾN NGHỊ...................................................................................................... 104

iii

DANH MỤC VIẾT TẮT

MT Môi trường

KL Khuẩn lạc

v/p Vòng/ phút

TB Tế bào

OD Optical Density

LAB Lactic acid bacteria

HHD Homofermentative-Heterofermentative Differrential

medium

WHO World Health Organization

GRAS Generally recognized as safe

BSH Bile salt hydrolase

LDL Low Density Lipoprotein

HDL High Density Lipoprotein

nm nanomet

16S rDNA Trình tự DNA mã hóa cho RNA ribosome tiểu phần

16S

ANOVA One-way analysis of variance

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp base pair

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic.....................................................11

Bảng 2.1 Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ

cholesterol và giá trị OD550 ........................................................................................27

Bảng 2.2. Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ taurine

và giá trị OD570 ..........................................................................................................29

Bảng 2.3. Xây dựng đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Albumin

và giá trị OD595 ..........................................................................................................30

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR .........................................................................43

Bảng 2.5 Chương trình phản ứng PCR.......................................................................43

Bảng 2.6 . Dấu hiệu sức khỏe của chuột.....................................................................46

Bảng 3.1 Tương quan giữa nồng độ cholesterol (µg/ mL)và giá trị OD550 ..................51

Bảng 3.2 Khả năng giảm cholesterol sau 24 giờ và 48 giờ .........................................53

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzym BSH của các chủng vi khuẩn ..........59

Bảng 3.4 Giá trị tương quan giữa nồng độ taurine (mM) và giá trị OD570...................61

Bảng 3.5 Mối quan hệ giữa nồng độ BSA (µg/ 0,2 mL) và giá trị OD595 ....................62

Bảng 3.6 Kết quả hoạt đô chung (U/ mL) và hoạt độ riêng (U/ mg) của các chủng vi

khuẩn.........................................................................................................................64

Bảng 3.7 Khả năng sinh enzym ngoại bào..................................................................68

Bảng 3.8 Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh (mm) .............................................71

Bảng 3.9 Kết quả thử khả năng chịu muối mật 0,3%..................................................76

Bảng 3.10 Tỉ lệ sống của các chủng thử nghiệm ở pH 2 trong thời gian 1 giờ, 2 giờ và

3 giờ (%)....................................................................................................................78

Bảng 3.11 Kết quả thử nghiệm khả năng huyết giải ...................................................80

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm MIC (µg/mL) ............................................................82

Bảng 3.13 Bảng tóm tắt kết quả sàng lọc đồng thời hoạt tính probiotic và khả năng

giảm cholesterol của 9 chủng vi khuẩn.......................................................................85

Bảng 3.14 Kết quả phân nhóm...................................................................................87

Bảng 3.15. Kết quả định danh nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình không bắt buộc

group B......................................................................................................................88

Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế ................................................89

v

Bảng 3.17 Kết quả hiệu chỉnh ....................................................................................90

Bảng 3.18 Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA đã hiệu chỉnh với các trình tự trên

GenBank....................................................................................................................91

Bảng 3.19 Kết quả khả năng tăng cholesterol giữa các nghiệm thức ..........................92

Bảng 3.20 Tính ổn định khả năng tăng cholesterol của các nghiệm thức theo thời gian

trình bày ....................................................................................................................92

Bảng 3.21 Bảng kết quả đo trọng lượng chuột trong 21 ngày .....................................93

Bảng 3.22 Chỉ số cholesterol sau khi gây tăng bằng chế độ ăn ...................................94

Bảng 3.23 Kết quả giảm cholesterol của các chủng thử nghiệm sau 120 ngày............95

Bảng 3.24 Trọng lượng của chuột trong thời gian gây tăng cholesterol......................99

Bảng 3.25 Trọng lượng của chuột trong thời gian thử nghiệm khả năng giảm

cholesterol của các chủng vi khuẩn ..........................................................................100

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ cholesterol (µg/ mL) và giá trị

OD550 .........................................................................................................................52

Đồ thị 3.2 Khả năng giảm cholesterol trong môi trường của các chủng thử nghiệm ...57

Đồ thị 3.3 Khả năng giảm cholesterol trong môi trường của các chủng thử nghiệm ...57

Đồ thị 3.4 Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ taurine (mM) và giá trị OD570 62

Đồ thị 3.5 Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ BSA (µg/ 0,2 mL) và giá trị

OD595 .........................................................................................................................63

Đồ thị 3.6 Biểu diễn hoạt độ chung (U/ mL) và hoạt độ riêng (U/ mg) của các chủng vi

khuẩn.........................................................................................................................67

Đồ thị 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn .............77

Đồ thị 3.8 Tỉ lệ sống của các chủng thử nghiệm theo thời gian 1, 2 và 3 giờ ở pH 2 ..79

Đồ thị 3.9 Kết quả giảm cholesterol của các chủng thử nghiệm sau 120 ngày ............96

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2. Streptococcus ............................................................................................12

Hình 1.3. Lactobacillus..............................................................................................12

Hình 1.4. Công thức cấu tạo cholesterol.....................................................................13

Hình 1.5. Cholesterol hình thành các mảng bám trong mạch máu ..............................14

Hình 1.6 Cơ chế tổng hợp cholesterol ........................................................................16

Hình 2.1 Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch đuôi (A), lô chuột thí nghiệm (B)..........................47

Hình 2.2 Thao tác cho chuột uống..............................................................................48

Hình 3.1. Vi khuẩn trên môi trường MRSA ...............................................................51

Hình 3.2. Khả năng sinh enzym BSH.........................................................................61

Hình 3.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ...............................................................70

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn S. typhi, L. monocytogenes.................75

Hình 3.5. Kết quả thử tiêu huyết trên thạch máu ........................................................81

Hình 3.6. Thử nghiệm MIC của chủng E16.2.............................................................84

Hình 3.5 Hình lên men trên môi trường HHD ............................................................87

Hình 3.7. Kết quả điện di sau phản ứng PCR .............................................................90

Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến tử vong và nó liên quan

chặt chẽ với việc tăng cholesterol. Do đó, giảm cholesterol huyết thanh là điều rất quan

trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lee và cs, 1992).

Do đó việc nghiên cứu các phương pháp làm giảm cholesterol trong máu là vấn

đề mà các nhà khoa học quan tâm và theo các nghiên cứu cho thấy rằng có nhiều

phương pháp làm giảm cholesterol trong máu. Sử dụng thuốc giúp làm giảm lượng

choleterol như: statins, các loại thuốc ức chế, fibrates, acid bile resin, niacin… tuy

nhiên khi sử dụng các loại thuốc này có thể gây ra một số tác dụng phụ. Các nghiên

cứu hiện nay chú trọng đến các phương pháp không sử dụng thuốc: các nghiên cứu tại

Mỹ, Nhật và Ấn Độ đã công bố Gamma Oryzanol (GO), vi chất tự nhiên trong lớp

màng gạo có khả năng giúp giảm cholesterol thừa bằng cách ngăn chặn ruột hấp thu

cholesterol từ thức ăn và do gan tiết ra, sau đó đào thải chúng ra khỏi cơ thể. Đồng thời

có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn cũng có khả năng làm giảm lượng

cholesterol trong máu (Foo, 2003). Điển hình là các chủng vi khuẩn lactic có khả năng

làm giảm lượng cholesterol nhờ khả năng sinh enzyme bile salt hydrolase và cơ chế

khử liên hợp muối mật.

Trên thị trường đã có nhiều loại chế phẩm thực phẩm chức năng giảm

cholesterol, tuy nhiên tác dụng không rõ ràng, giá thành rất cao, do đó người dùng khó

tiếp cận. Bên cạnh đó, cũng có nhiều dược phẩm được chứng minh hiệu quả tốt nhưng

chỉ dùng để điều trị, ít khi sử dụng để dự phòng nguy cơ vì không sử dụng lâu dài

được.

Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy một số vi khuẩn làm probiotic, trong đó có

Lactobacillus có khả năng làm giảm cholesterol. Các chế phẩm này an toàn, có thể sử

dụng lâu dài để làm giảm nguy cơ tăng cholesterol. Do đó, đây là vấn đề đang được

các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu nhưng ở Việt Nam, hiện chưa có

nhóm tác giả nào công bố về vấn đề này, trong khi sản phẩm probiotic có tác dụng làm

giảm cholesterol là rất cần thiết.

Bên cạnh đó chúng tôi được thừa kế từ bộ sưu tập chủng vi khuẩn lactic có hoạt

tính probiotic từ nghiên cứu trước. Từ đó, tái phân lập, xác định khả năng làm giảm

Trang 2

cholesterol qua cơ chế hấp thu và khử liên hợp muối mật, tiến hành đánh giá hiệu quả

làm giảm cholesterol và các hoạt tính probiotic trên chuột và định danh đến loài bằng

phương pháp giải trình tự chủng vi khuẩn cho hoạt tính probiotic và giảm cholesterol

mạnh nhất.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC

CÓ HOẠT TÍNH GIẢM CHOLESTEROL”

Nội dung thực hiện đề tài bao gồm:

- Tái phân lập và sàng lọc các chủng đồng thời có hoạt tính probiotic và giảm

cholesterol.

- Định danh các chủng vi khuẩn theo 2 phương pháp: truyền thống và sinh học

phân tử.

- Xây dựng mô hình chuột gây tăng cholesterol.

- Thử nghiệm hiệu quả giảm cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm.

Trang 3

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU