Sàng lọc vi khuẩn vùng lúa ngập mặn có khả năng kiểm soát một số nấm gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM

----------------

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

SÀNG LỌC VI KHUẨN VÙNG LÚA NGẬP MẶN CÓ

KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH

TRÊN CÂY LÚA

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ VI SINH

GVHD: ThS. Nguyễn Văn Minh

SVTT: Đinh Thị Hiền

MSSV: 1153010241

Khóa: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, Tháng 05 Năm 2015

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

LỜI CẢM ƠN



Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô khoa Công Nghệ

Sinh Học đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt những năm vừa qua để em

làm tốt đề tài khóa luận này.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh, cô Dương Nhật Linh đã tận tình

hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Con xin cảm ơn gia đình đã luôn động viên, quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất

để con hoàn thành việc học của mình.

Em xin cảm ơn chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, các bạn và các em

trong phòng vi sinh đã ủng hộ, quan tâm và giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện đề

tài.

Một lần nữa, em xin gửi đến thầy cô, các bạn và các em lời chúc sức khỏe, lời biết ơn

chân thành nhất. Chúc mọi người luôn may mắn, gặt hái được nhiều thành công.

Em xin chân thành cảm ơn.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 5 năm 2015

Sinh viên thực hiện

ĐINH THỊ HIỀN

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN i

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Nấm Pyricularia oryzae (A) và biểu hiện bệnh đạo ôn trên lúa do nó gây nên (B,

C).............................................................................................................................................11

Hình 1.2: Nấm Rhizoctonia solani (A) và biểu hiện bệnh khô vằn trên lúa do nó gây nên (B)

.................................................................................................................................................14

Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...........................................................................................27

Hình 3.1: Phân lập mẫu nước (A) và đất trên vùng trồng lúa (B) ..........................................53

Hình 3.2: Phân lập vi khuẩn nội sinh trên mẫu thân cây lúa (A) và đĩa TSA đối chứng (B).53

Hình 3.3: Hình thái vi thể (A) và đại thể của chủng LĐ7 (B)................................................54

Hình 3.4: Hình thái vi thể (A) và đại thể của chủng LN5 (B)................................................54

Hình 3.5: Hình thái vi thể (40X) (A) và đại thể (B) của chủng nấm BP1 ..............................61

Hình 3.6: Hình thái vi thể (40X) (A) và đại thể (B) của chủng nấm CR1..............................63

Hình 3.7: Các dấu hiệu bệnh đạo ôn trên lô bệnh (A, B) và lô đối chứng (C).......................64

Hình 3.8: Các dấu hiệu bệnh khô vằn trên lô bệnh (A, B) và lô đối chứng (C).....................64

Hình 3.9: Hình thái vi thể (40X) (A) và đại thể của chủng nấm Pyricularia BP3 (B)...........65

Hình 3.10: Hình thái vi thể (40X) (A) và đại thể của chủng nấm Rhizoctonia CR1 (B) .......66

Hình 3.11: Khả năng kháng nấm Pyricularia BP3 của chủng LN6 (A) và đối chứng (B) ....68

Hình 3.12: Khả năng kháng nấm Rhizoctonia CR1 của chủng LN6 (A)và đối chứng (B) ....68

Hình 3.13: Khả năng kiểm soát nấm Pyricularia BP3 của chủng LD5 (A) và đĩa đối chứng

(B) ...........................................................................................................................................70

Hình 3.14: Khả năng kiểm soát nấm Rhizotocnia CR1 của chủng LD5 (A) và đĩa đối chứng

(B) ...........................................................................................................................................70

Hình 3.15: Đĩa cấy thạch vuông góc của chủng LS6 và LD5 ................................................73

Hình 3.16: Đĩa ủ hạt giống sau 2 ngày trên đĩa agar (A) và lúa cấy 0 ngày (B) ....................76

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN ii

Hình 3.18: Nghiệm thức bổ sung chủng vi khuẩn N-2C2 (A) và nghiệm thức chỉ bổ sung

chủng Pyricularia BP3 (B).....................................................................................................76

Hình 3.17: Nghiệm thức bổ sung chủng vi khuẩn N-2C1 (A) và nghiệm thức chỉ bổ sung

chủng Rhizotocnia CR1 (B)....................................................................................................77

Hình 4.1: Định danh Bacillus sp. theo khóa phân loại Cowan và Steels...............................98

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Sản lượng lúa các nước Châu Á và sản lượng, diện tích lúa trên thế giới...............6

Bảng 1.1: Khả năng chịu mặn của một số loại cây.................................................................17

Bảng 3.1: Đặc điểm đại thể của các chủng vi khuẩn phân lập ...............................................45

Bảng 3.2: Kết quả quan sát vi thể của các chủng phân lập.....................................................49

Bảng 3.3: Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn thử nghiệm .....................................55

Bảng 3.4: Tóm tắt kết quả phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn.....................................59

Bảng 3.5: Kết quả phân lập vi nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa ................................................61

Bảng 3.6: Kết quả phân lập vi nấm gây bệnh khô vằn trên lúa ..............................................62

Bảng 3.6: Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn thử nghiệm......................67

Bảng 3.8: Phần trăm ức chế nấm gây bệnh của dịch vi khuẩn thử nghiệm tại nồng độ 0,4%

NaCl ........................................................................................................................................69

Bảng 3.9: Các thử nghiệm định danh Bacillus .......................................................................71

Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm kháng nấm in vivo ...............................................................74

Bảng 3.7: Khả năng ức chế nấm gây bệnh của dịch vi khuẩn thử nghiệm tại nồng độ 0,4%

NaCl ........................................................................................................................................93

Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kiểm soát nấm bệnh trên mô hình lúa thực nghiệm

.................................................................................................................................................99

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

LPCB: Lactophenol Cotton Blue Slide Mounths

NA: Nutrient Agar

NB: Nutrient Broth

PDA: Potato Dextrose Agar

TSA: Trypticase Soy Agar

CFU : Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN v

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH………………………………………………………………….i

DANH MỤC BẢNG....................................................................................................iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................iv

MỤC LỤC.....................................................................................................................v

ĐẶT VẤN ĐỀ ...............................................................................................................1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3

1.1. Giới thiệu về cây lúa....................................................................................4

1.1.1. Sơ lược về cây lúa. ...................................................................................4

1.1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới...................................................5

1.1.3. Tình hình sản xuất lúa gạo trong nước.....................................................6

1.2. Bệnh do nấm trên lúa...................................................................................7

1.2.1. Bệnh đạo ôn..............................................................................................7

1.2.2. Bệnh khô vằn..........................................................................................11

1.3. Tình hình xâm nhập mặn ở đồng bằng sông Cửu Long............................15

1.4. Khả năng chịu mặn của cây lúa.................................................................16

1.4.1. Ảnh hưởng của độ mặn đến cây trồng ...................................................16

1.4.2. Cơ chế chống chịu của lúa .....................................................................18

1.5. Vi sinh vật nội sinh.....................................................................................20

1.5.1. Sơ lược về vi sinh vật nội sinh...............................................................20

1.5.2. Các nghiên cứu trên thế giới ..................................................................21

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN vi

1.5.3. Các nghiên cứu trong nước ....................................................................21

1.6. Vi khuẩn tự do vùng rễ giúp thúc đẩy thực vật phát triển (PGPR)...........22

1.6.1. Sơ lược về vi khuẩn tự do vùng rễ thúc đẩy thực vật phát triển (PGPR) ..

................................................................................................................21

1.6.2. Các nghiên cứu trên thế giới ..................................................................23

1.6.3. Các nghiên cứu trong nước ....................................................................23

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP..........................................................24

2.1. Địa điểm và th i gian nghiên cứu .............................................................25

2.2. Vật liệu ......................................................................................................25

2.3. Thiết bị, dụng cụ và môi trư ng................................................................25

2.3.1. Thiết bị ...................................................................................................25

2.3.2. Dụng cụ ..................................................................................................25

2.3.3. Môi trư ng - Hóa chất............................................................................26

2.4. Phương pháp thực hiện..............................................................................26

2.4.1. Bố trí thí nghiệm ....................................................................................26

2.4.2. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu......................................................28

2.4.3. Phương pháp phân lập và làm thuần vi khuẩn chịu mặn .......................29

2.4.4. Phân lập và làm thuần vi nấm gây bệnh trên cây lúa.............................29

2.4.5. Định danh sơ bộ nấm bệnh.....................................................................30

2.4.6. Gây bệnh nhân tạo trên mô hình lúa ......................................................31

2.4.7. Định tính khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây lúa của các chủng vi

khuẩn thử nghiệm...................................................................................................32

2.4.8. Định lượng khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây lúa của dịch lọc vi

khuẩn thử nghiệm...................................................................................................33

2.4.9. Phương pháp định danh vi khuẩn...........................................................34

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN vii

2.4.10. Khảo sát khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn thử nghiệm .41

2.4.11. Khảo sát khả năng kiểm soát sinh học nấm bệnh trên mô hình trồng

lúa .............................................................................................................41

2.4.12. Xử lý kết quả.......................................................................................43

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................44

3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn.........................................................................45

3.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn.................54

3.3. Tóm tắt kết quả phân lập và sàng lọc........................................................59

3.4. Phân lập vi nấm gây bệnh đạo ôn và khô vằn trên cây lúa .......................60

3.4.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh.....................................................................60

3.4.2. Kết quả phân lập vi nấm gây bệnh.........................................................61

3.5. Gây bệnh trên mô hình trồng lúa...............................................................63

3.6. Định danh vi nấm gây bệnh.......................................................................65

3.7. Khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn thử nghiệm...............................66

3.8. Định lượng khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây lúa của dịch lọc vi

khuẩn thử nghiệm.........................................................................................................68

3.9. Định danh vi khuẩn ...................................................................................71

3.10. Khảo sát khả năng tương thích của các chủng vi khuẩn thử nghiệm........72

3.11. Khảo sát khả năng kiểm soát sinh học nấm bệnh trên mô hình trồng lúa.73

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................78

4.1. Kết luận .....................................................................................................79

4.2. Kiến nghị ...................................................................................................79

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................81

PHỤ LỤC ...................................................................................................................90

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 2

Lúa là một trong năm loại lương thực chính trên thế giới. Đây là cây trồng quan trọng

nhất nên cũng là nguồn thu nhập chính của đại bộ phận nông dân. Việt Nam là nước đứng

thứ 3 thế giới về xuất khẩu gạo (Trung Nghĩa, 2014), trong 6 tháng đầu năm 2014, xuất khẩu

đạt 3,261 triệu tấn, kim ngạch đạt 1,474 tỉ USD (Bộ Công Thương, 2014). Đồng bằng sông

Cửu Long (ĐBSCL) là đồng bằng lớn nhất nước ta, được mệnh danh là "bát gạo" của Việt

Nam với diện tích hơn 4 triệu hecta đất tự nhiên. Năm 2010, vùng có tổng diện tích trồng lúa

là 3790 ha, sản lượng đạt 21,55 triệu tấn chiếm 56% sản lượng gạo cả nước, trong đó xuất

khẩu gạo đạt 6,754 triệu tấn, giá trị xuất khẩu đạt 2,912 tỷ USD (Lê Thanh Tùng, 2014).

Trong mùa cạn, khi nước từ thượng nguồn về thấp, thủy triều xuất hiện mang nước

mặn xâm nhập sâu vào nội đồng, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu, mực nước biển

dâng cao, đây là nguyên nhân cơ bản khiến cho sự xâm nhập mặn ở những vùng ven biển

ngày càng trở nên nghiêm trọng hơn, khoảng 2,4 triệu ha chiếm 59,5 % diện tích tự nhiên

của vùng (Hồ Quang Đức, 2013). Do đó các vùng sản xuất lúa ven biển thuộc các tỉnh như

Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau,… thư ng xuyên bị xâm nhập mặn. Đất

mặn làm cây trồng bị suy yếu, giảm năng suất… đồng th i tăng khả năng nhiễm bệnh do

nấm. Nấm bệnh khả năng phát tán trong gió, theo nguồn nước… nếu không kịp th i xử lý,

nấm bệnh có khả năng phát triển thành dịch cao dẫn đến làm giảm năng suất và chất lượng:

hạt lúa bị lép, đốm đen, gạo bị gãy nát khi xay sát, chất lượng gạo thấp (Vũ Triệu Mân,

2007).

Việc sử dụng phương pháp hoá học có thể làm giảm thiệt hại do nấm bệnh gây ra

nhưng sử dụng lâu dài lại ảnh hưởng xấu đến môi trư ng sinh thái, tạo các chủng kháng

thuốc, ảnh hưởng đến sức khỏe ngư i sử dụng (Moenne, 1998). Việc ứng dụng công nghệ

sinh học trong sản xuất nông nghiệp là một vấn đề thiết thực hiện nay nhằm mang lại các

biện pháp hiệu quả thân thiện với môi trư ng, cung cấp một nguồn thực phẩm an toàn và có

giá trị kinh tế cao.

Vi khuẩn vùng rễ là hệ vi khuẩn cư trú trong khu vực đất bao quanh vùng rễ. Hệ vi

khuẩn và các sản phẩm của chúng tương tác với các chất được thực vật tiết ra có thể tạo ra

các tương tác tích cực, tiêu cực hoặc trung lập làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát