Sàng lọc vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic dùng cho cá tra nuôi / Nguyễn Văn Minh

i

ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................1

HƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................4

1.1 TÌNH HÌNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM..............................5

1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản .............................................................5

1.1.2 Tình hình nuôi trồng cá tra ..................................................................5

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC BỆNH THƯỜNG GẶP TRÊN CÁ TRA ................6

1.2.1 Bệnh gan thận mủ trên cá tra...............................................................6

1.2.2 Bệnh trắng gan, trắng mang ..............................................................10

1.2.3 Bệnh xuất huyết trên cá tra................................................................12

1.3 VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ...................................................12

1.3.1 Hệ thống phân loại ............................................................................12

1.3.2 Đặc điểm sinh hóa .............................................................................13

1.3.3 Con đường xâm nhiễm của Edwardsiella ictaluri ............................14

1.4 PROBIOTIC – CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY

SẢN 14

1.4.1 Định nghĩa probiotic..........................................................................15

1.4.2 Cơ chế tác động của probiotic trong nuôi trồng thủy sản .................16

1.5 VI KHUẨN BACILLUS.................................................................................19

1.5.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus......................................................19

1.5.2 Dinh dưỡng và phát triển...................................................................20

1.5.3 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản.............................20

HƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU....................21

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...............................................22

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...........................................................................22

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu........................................................................22

2.2.2 Chủng vi khuẩn thử nghiệm..............................................................22

2.2.3 Cá tra dùng để thử nghiệm ................................................................22

2.2.4 Môi trường - hóa chất........................................................................22

ii

2.2.5 Thiết bị - dụng cụ ..............................................................................22

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................24

2.3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm................................................................24

2.3.2 Phân lập Bacillus...............................................................................25

2.3.3 Thử đối kháng với Edwardsiella ictaluri ..........................................26

2.3.4 Thử khả năng sinh enzym ngoại bào.................................................28

2.3.5 Khảo sát khả năng chịu muối môi trường nuôi và pH môi trường

nuôi ...........................................................................................................29

2.3.6 Thử khả năng chịu đựng acid dạ dày ................................................30

2.3.7 Thử khả năng chịu muối mật.............................................................30

2.3.8 Thử nghiệm khả năng nhạy/ kháng kháng sinh (MIC) .....................31

2.3.9 Đánh giá tính an toàn của các chủng Bacillus tiềm năng với vật

chủ ...........................................................................................................32

2.3.10 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus spp. lên cá tra

bột ...........................................................................................................33

2.3.11 Thí nghiệm đánh giá mật độ gây nhiễm thích hợp của chủng

Edwardsiella ictaluri lên cá tra bột...........................................................................33

2.3.12 Thí nghiệm khả năng bảo vệ vật chủ (cá tra bột) ở qui mô phòng

thí nghiệm của Bacillus với Edwardsiella ictaluri ...................................................34

2.3.13 Xây dựng đường tương quan giữa giá trị OD và mật độ tế bào vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri......................................................................................35

2.3.14 Xác định liều gây chết trung bình - LD50 ........................................36

2.3.15 Thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ (cá tra giống) ở quy

mô phòng thí nghiệm của vi khuẩn Bacillus với Edwardsiella ictaluri ...................37

2.3.16 Xử lý kết quả.....................................................................................39

2.3.17 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự .............................39

HƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................44

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP BACILLUS...............................................................45

3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG .....................................................................47

3.2.1 Phương pháp cấy vạch vuông góc.....................................................47

iii

3.2.2 Phương pháp đổ thạch hai lớp...........................................................49

3.2.3 Kết quả xác định phần trăm ức chế của dịch lên men của 3 chủng

Bacillus spp. với Edwardsiella ictaluri.....................................................................51

3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG SINH ENZYM NGOẠI BÀO.....52

3.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI VÀ PH MÔI

TRƯỜNG NUÔI.......................................................................................................52

3.4.1 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối môi trường nuôi ...............52

3.4.2 Kết quả khả năng chịu pH môi trường nuôi......................................52

3.5 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỊU ACID DẠ DÀY................53

3.5.1 Thử nghiệm khả chịu pH = 2.............................................................53

3.5.2 Kết quả khả năng chịu pH = 3...........................................................53

3.6 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI MẬT .....................55

3.6.1 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối mật 0,5%..........................55

3.6.2 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối mật 1%.............................55

3.6.3 Kết quả thử nghiệm khả năng chịu muối mật 2%.............................56

3.7 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG NHẠY/ KHÁNG VỚI KHÁNG

SINH 57

3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CÁC

CHỦNG BACILLUS TIỀM NĂNG VỚI VẬT CHỦ ...............................................58

3.8.1 Kết quả đánh giá khả năng dung huyết .............................................58

3.8.2 Kết quả thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus spp. lên

cá tra bột 59

3.9 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ GÂY NGHIỄM THÍCH HỢP CỦA

CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI LÊN CÁ TRA BỘT ..................................60

3.10 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM KHẢ NĂNG BẢO VỆ VẬT CHỦ (CÁ TRA

BỘT) Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA BACILLUS VỚI

EDWARDSIELLA ICTALURI...................................................................................61

3.11 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA GIÁ TRỊ OD VÀ

MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI ..............................62

iv

3.12 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LIỀU GÂY CHẾT TRUNG BÌNH – LD50 CỦA

EDWARDSIELLA ICTALURI LÊN CÁ TRA GIỐNG.............................................62

3.13 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM KHẢ NĂNG BẢO VỆ VẬT CHỦ (CÁ TRA

BỘT) Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA BACILLUS VỚI EDWARDSIELLA

ICTALURI .................................................................................................................63

3.14 kẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH

TỰ ........................................................................................................................66

3.14.1 Kết quả hiệu chỉnh trình tự ...............................................................66

3.14.2 Kết quả so sánh trình tự trên cơ sở dữ liệu GenBank.......................66

3.15 TỒNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................68

HƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................70

4.1 KẾT LUẬN....................................................................................................71

4.2 ĐỀ NGHỊ........................................................................................................71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................72

PHỤ LỤC 1...............................................................................................................79

PHỤ LỤC 2...............................................................................................................81

PHỤ LỤC 3...............................................................................................................84

PHỤ LỤC 4...............................................................................................................86

DANH M C CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của E. ictaluri (Holt và cs., 1994)...............................13

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR........................................................................42

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR................................................................42

Bảng 3.1 Kết quả phân lập ........................................................................................45

Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc................47

Bảng 3.3 Kết quả đường kính vòng kháng................................................................49

Bảng 3.4 Tỉ lệ phần trăm ức chế ...............................................................................51

Bảng 3.5 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào..............................52

Bảng 3.6 Thử nghiệm khả năng chịu muối ở các nồng độ khác nhau ......................52

Bảng 3.7 Thử nghiệm khả năng chịu pH ở các nồng độ khác nhau .........................52

Bảng 3.8 Phần trăm sống sót của chủng thử nghiệm trong môi trường pH = 2 .......53

Bảng 3.9 Tỉ lệ phần trăm vi khuẩn sống sót trong môi trường pH= 3 (đơn vị: CFU/

mL)............................................................................................................................54

Bảng 3.10 Phần trăm sống sót của các chủng thử nghiệm trong môi trường có nồng

độ muối mật 0,5% ( đơn vị: %).................................................................................55

Bảng 3.11 Phần trăm sống sót của các chủng thử nghiệm trong môi trường thử muối

mật nồng độ 1% (đơn vị: %).....................................................................................56

Bảng 3.12 Phần trăm sống sót của các chủng trong môi trường muối mật có nồng độ

2 % ( đơn vị: %) ........................................................................................................56

Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm MIC (µg/ml)............................................................57

Bảng 3.14 Kết quả khả năng gây dung huyết ...........................................................58

Bảng 3.15 Tỷ lệ sống của cá tra bột sau 48 h bổ sung Bacillus spp. ........................59

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát LD50 trên cá tra bột sau 48 h bổ sung E. ictaluri .........60

Bảng 3.17 Tỷ lệ sống (%) của cá tra bột sau 48 h ở thí nghiệm ...............................61

Bảng 3.18 Giá trị OD610 và mật độ tế bào (log (N/ mL)...........................................62

Bảng 3.19 Kết quả LD50............................................................................................63

Bảng 3.20 Tỉ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm với E. ictaluri ...............................64

Bảng 3.21 Kết quả hiệu chỉnh trình tự ......................................................................66

Bảng 3.22 Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của chủng Bacillus Q16 và Bacillus

Q111 ............................................................................................................................67

Bảng 3.23 Kết quả thử nghiệm sinh hóa ...................................................................67

Bảng 3.24 Bảng kết quả tổng hợp.............................................................................68

Bảng 0.1Bảng một số test sinh hóa phân biệt với Bacillus subtilis..........................89

DANH M SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm.................................................................................24

Sơ đồ 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ cá tra giống trong điều

kiện gây nhiễm Edwardsiella ictaluri của chủng Bacillus Q16 và Bacillus Q111 ......38

Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết DNA của vi khuẩn Bacillus.....................................41

DANH M C BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Khả năng đối kháng của Bacillus spp. theo thời gian đối với chủng E.

ictaluri ......................................................................................................................50

Biểu đồ 3.2 Phần trăm ức chế ..................................................................................51

Biểu đồ 3.3 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở pH = 2 ......................53

Biểu đồ 3.4 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở pH = 3 ...................... 54

Biểu đồ 3.5 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở môi trường có nồng độ

muối mật 0,5% theo thời gian .................................................................................. 55

Biểu đồ 3.6 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở môi trường có nồng độ

muối mật 1% theo thời gian ..................................................................................... 56

Biểu đồ 3.7 Khả năng sống sót của các chủng thử nghiệm ở môi trường có nồng độ

muối mật 2% theo thời gian ..................................................................................... 57

Biểu đồ 3.8 Tỉ lệ sống của cá tra bột sau 48 h bổ sung Bacillus spp....................... 59

Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ chết dồn của cá tra bột sau 48 h bổ sung E. ictaluri ...................60

Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ sống của cá tra bột sau 48h ở thí nghiệm................................... 61

Biểu đồ 3.11 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri .....................................................................................62

NH CÁC H NH

Hình 1.1 Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A); Biểu hiện đặc trưng của

bệnh gan thận mủ (B)..................................................................................................8

Hình 1.2 Cá bệnh (trên), cá khỏe (dưới) ...................................................................10

Hình 1.3 Cá tra bị xuất huyết bụng ...........................................................................12

Hình 1.4 Hình nhuộm Gram vi khuẩn E. ictaluri (A), hình khuẩn lạc đặc trưng của

vi khuẩn E. ictaluri trên môi trường thạch máu (B) .................................................13

Hình 2.1 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc....................................................27

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử nghiệm

lên cá tra bột ..............................................................................................................33

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm đánh giá mật độ gây nhiễm thích hợp của chủng

Edwardsiella ictaluri lên cá tra bột...........................................................................34

Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. lên cá tra

bột..............................................................................................................................35

Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus Q16 và Bacillus Q111 trên môi trường NA sau

24 h nuôi cấy .............................................................................................................47

Hình 3.2 Nhuộm Gram Bacillus Q16 và Bacillus Q111...............................................47

Hình 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ................49

Hình 3.4 Thử nghiệm khả năng chịu pH = 3 của chủng Q16.....................................54

Hình 0.1Hình chạy điện di trên gel agarose và chụp hình bằng máy Bio-rad ..........81

Hình 0.2 Kết quả thử CMC.......................................................................................81

Hình 0.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của vi khuẩn khảo sát lên tỉ lệ sống của cá...........81

Hình 0.4 Cá khi bị bệnh gan thận mủ .......................................................................82

Hình 0.5 Kết quả thử khả năng sinh β-D-glucosidase ..............................................82

Hình 0.6 Đông khô thu sinh khối Bacillus Q16 và Bacillus Q111 ..............................83

Hình 0.7 Trình tự 16S rDNA sau khi hiệu chỉnh của chủng Bacillus Q16 ................84

Hình 0.8 Trình tự 16S rDNA sau khi hiệu chỉnh của chủng Bacillus Q111...............85

DANH M C CHỮ VIẾT TẮT

16S rDNA subunit ribosomal deoxyribonucleic acid

16S rRNA subunit ribosomal ribonucleic acid

ANOVA One-way analysis of variance

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BOD Biochemical Oxygen Demand

bp base pair

CFU Colony Forming Unit

CMC Carboxymethyl cellulose

cs. Cộng sự

ddNTP dideoxynucleotide triphosphate

DNA Deoxyribo Nucleotide Triphosphate

ĐBS Đồng bằng sông Cửu Long

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

h Giờ

LD50 Lethal Dose 50%

NTTS Nuôi trồng thủy sản

OD Optical Density

PTN Phòng thí nghiệm

rRNA ribosomal ribonucleic acid

VSV Vi sinh vật

WHO World Health Organization

Mẫu 11. Thông tin kết quả nghiên cứu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Đơn vị: Trường ĐH ở TPHCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: Sàng lọc vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic dùng cho cá tra

nuôi (Pangasianodon hypophthalmus)

- Mã số:

- Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Văn Minh

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Mở TPHCM

- Thời gian thực hiện: 11/ 2007 - 4/ 2013