Phát triển một phương pháp "không xâm lấn" (Non invation) nhằm tiên lượng và chuẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung trên người bệnh Việt Nam / Trương Kim Phượng [Chủ nhiệm]

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài:

PHÁT TRIỂN MỘT PHƯƠNG PHÁP KHÔNG

XÂM LẤN (NON INVATION) NHẰM TIÊN

LƯỢNG VÀ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ CỔ

TỬ CUNG TRÊN NGƯỜI BỆNH VIỆT NAM

Mã số: T2014.09.176

Chủ nhiệm: ThS. Trương Kim Phượng

Thành viên: PGS.TS. Lê Huyền Ái Thúy

ThS. Lao Đức Thuận

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 11/2015

1 MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 11

PHẦN I.TỔNG QUAN 13

I.1.UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 13

I.1.1.Đặc điểm sinh học của ung thư cổ tử cung 13

I.1.2.Một số yếu tố nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung 13

I.1.3.Virus HPV 14

I.1.4. Cơ chế xâm nhiễm, gây bệnh ung thư cổ tử cung 14

I.1.5. Phương pháp chẩn đoán ung thư cổ tử cung 17

I.2.TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT

NAM 20

I.3.TỔNG QUAN EPIGENETICS – SỰ METHYL HÓA DNA 22

I.3.1. Epigenetics 22

I.3.2. Sự methyl hóa DNA 23

I.3.2.2. Đảo CpG 24

I.3.2.3. Họ enzym methyltransferase 24

I.3.2.4. Sự methyl hóa DNA bất thường 25

I.4. TỔNG QUAN VỀ CÁC GENE DAPK, RARβ, p16INK4a 26

I.4.1. Gene DAPK (Death-Associated Protein Kinase) 26

I.4.2. Gene p16INK4α (CDKN2A, Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A) 27

I.4.3. Gene RARβ (Retinoic acid receptor beta) 28

I.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN SỰ

METHYL HÓA DNA 30

I.5.1. Phương pháp MSP 30

I.5.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) 32

I.5.3. Phương pháp QMSP 32

PHẦN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

II.1.VẬT LIỆU 34

II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

II.2.1. Tách chiết DNA 34

Trang i

II.2.2. Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận 35

II.2.3. Thực hiện phản ứng MSP và BSP trên mẫu bệnh phẩm 38

II.2.4. Mồi 40

II.2.5. Phân tích số liệu 41

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

IV.1. KẾT LUẬN 55

IV.2. ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình I.1. Sự xâm nhiễm và tiến trình gây ung thư cổ tử cung của virus HPV 16

Hình I.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong do các loại ung thư khác nhau

ở nữ giới trên Việt Nam (GLOBOCAN 2012, IARC) 21

Hình I.3. Sự methyl hóa cytosine (Bestor, 2000) 24

Hình I.4. Phương pháp MSP 30

Hình I.5. Xử lý sodium bisulfite 31

Hình I.6. Đọc kết quả MSP 32

Hình III.1. Phân tích đặc điểm methyl hóa vùng promoter của gene p16INK4a trên các

mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp MSP 51

Hình III.2. Giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gene RARβ 52

Hình III.3. Giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gene DAPK 53

Hình III.4. Giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gene p16INK4a 54

Trang iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng II.1. Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite của EpiTect bisulfite Kit 38

Bảng II.2. Thành phần của phản ứng PCR trong phương pháp MSP và BSP 39

Bảng II.3. Chu kì nhiệt của phản ứng MSP và BSP 39

Bảng II.4. Tên và trình tự các mồi sử dụng 40

Bảng III.1. Tần số methyl hóa của các gene DAPK, RARβ và p16INK4a không

nhiễm/nhiễm type lành 40

Bảng III.2. Tần số methyl hóa của các gene DAPK, RARβ và p16INK4a trong bộ mẫu

dịch phết tế bào âm đạo nhiễm HPV type độc và không nhiễm/nhiễm type lành 48

Bảng III.3.Chỉ số OR về mức độ methyl hóa của các gene DAPK, RARβ và p16INK4a

với

tính chất nhiễm HPV type độc và tính chất không nhiễm/nhiễm type lành 48

Bảng III.4. Chỉ số RR về mức độ methyl hóa của các gene DAPK, RARβ và p16INK4a

với

tính chất nhiễm HPV type độc và tính chất không nhiễm/nhiễm type lành 50

1

Trang iv

1 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

5’UTR 5’ Untranslated Region

3’UTR 3’ Untranslated Region

A Adenine

C Cytosine

G Guanine

T Thymine

bp Base pair

CDKN2A Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A

DAPK Death-Associated Protein Kinase 1

RARβ Retinoic acid receptor β

pRB Prepro-Retinoblastoma-Associated Protein

AC Adenocarcinoma

ASC Adenosquamous Carcinoma

BSP Bisulfite Sequencing PCR

CDKN1B Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1B (p27, Kip1)

CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia

DNA Deoxyribonucleic Acid

DNMT DNA Methyltransferase

dNTP Deoxynucleoside Triphosphate

ER Receptor Estrogene

HBV Hepatitis B virus

HGSIL High Grade Squamous Intraepithelial Lesion

HPV Human Papilloma virus

IARC International Agenecy for Research on Cancer

IDT Integrated DNA Technology (công ty IDT)

LGSIL Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion

M Methylated

mRNA Messenger Ribonucleic acid

MSP Methylation specific PCR

NCBI National Center for Biotechnology Information

Trang v