Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Đậu tương là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới.

Hạt đậu tương có hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, chứa 40% - 50%

protein, 18% -25% lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan,

metionin, xystein, lozin...) và nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K...), là

nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống con người.

Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi

khuẩn cố định đạm nên cây đậu tương thường được trồng luân canh với lúa và

ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu. Với những giá trị to lớn đó mà cây đậu

tương được trồng phổ biến ở nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ

550

vĩ Bắc đến 550

vĩ Nam, từ vùng thấp hơn mực nước biển cho đến vùng

cao trên 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng hơn 74,4 triệu ha

[4], [9]. Trong đó, chúng được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Braxin, Argentina,

Trung Quốc, Ấn Độ.

Ở Việt Nam cây đậu tương được gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp

trên cả nước. Các giống đậu tương ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các

giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và tập đoàn

các giống đậu tương địa phương. Các giống đậu tương địa phương đa dạng và

phong phú cả về kiểu hình và kiểu gen, đây là nguồn nguyên liệu để chọn tạo

giống đậu tương mới cho năng suất và chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn

giống [9].

Tạo giống đậu tương mới có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu với

các điều kiện bất lợi do biến đổi khí hậu luôn được các nhà tạo giống quan

tâm. Bên cạch các phương pháp truyền thống, phương pháp tạo giống bằng

công nghệ sinh học đã và đang là phương pháp mang lại hiệu quả cao trong

công tác chọn giống cây đậu tương với các tính trạng mong muốn. Ở Việt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2

Nam, tạo giống đậu tương bằng công nghệ sinh học mới đang bắt đầu được

quan tâm nghiên cứu. Một trong những công cụ quan trọng của tạo giống

bằng công nghệ sinh học là kĩ thuật chọn dòng tế bào soma, với tần suất tạo

biến di truyền ngẫu nhiên trong khoảng 10-5

- 10-8

, nuôi cấy mô sẹo được xem

như là nguồn vật liệu phong phú cho việc chọn dòng tế bào có tính chống

chịu ở cây trồng (Lê Trần Bình và cs, 1997) [1] .

Vì vậy, phát triển hệ thống tái sinh là một trong các khâu quan trọng

trong việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tạo giống theo hướng tăng

cường khả năng chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi của cây đậu

tương. Xuất phát từ lí do trên chúng tôi đã lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ

là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở

cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill].

2. Mục tiêu nghiên cứu

Tạo dòng đậu tương từ mô sẹo chịu mất nước bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu điều kiện tối ưu khử trùng hạt sử dụng trong nuôi cấy in vitro.

- Khảo sát môi trường tạo mô sẹo phôi hạt đậu tương.

- Đánh giá khả năng chịu hạn của đậu tương bằng kỹ thuật thổi khô mô sẹo ở

các ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, 7 (giờ).

- Khảo sát môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh

- Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự thay đổi hệ gen của các dòng đậu

tương tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước.

- Thiết lập sơ đồ hình cây và xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng

đậu tương nghiên cứu.

- Tuyển chọn các dòng đậu tương ưu tú để tiếp tục theo dõi, đánh giá ở các

thế hệ tiếp sau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG

1.1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng

Đậu tương có tên khoa học là (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu

(Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có bộ NST 2n = 40, có

nguồn gốc từ Trung Quốc là loại cây trồng hàng năm không thấy xuất hiện ở

loài hoang dại. Các giống đậu tương địa phương của nước ta hiện nay được

du nhập từ Trung Quốc đã từ lâu [4].

Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, khó có thế tìm thấy loại cây

nào có tác dụng nhiều mặt và hiệu quả kinh tế cao như cây đậu tương. Về

thực phẩm hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao 40% - 50% protein,

18% - 25 % lipit và 20% gluxit [9]. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt

nhất trong các loại protein của thực vật, có đầy đủ và cân đối các loại axit

amin cần thiết. Lipit của đậu tương chúa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ

số đồng hóa lớn (98%), chỉ số iot cao (120- 137) có tác dụng phòng chống

bệnh biếu cổ cho người, đặc biệt đối với vùng trung du và miền núi. Hạt đậu

tương còn chứ nhiều khoáng và có khả năng cung cấp năng lượng khá lớn

(4.710kcal), cho nên người ta đã chế biến hạt đậu tương thành hơn 600 sản

phẩm khác nhau [9].

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất

trong các cây lấy dầu. Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980

trở lại đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào

tăng năng suất và diện tích. Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng

nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha. Các nước sản xuất đậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4

tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm

khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới [9].

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, trong

đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng bằng

Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%,

đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền

Trung 1,6% [9]. Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền

nông nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế

chưa phát triển.

Tuy nhiên, việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được đầu tư

cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học

của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi với

điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền thống

kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó cũng

là chiến lược quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta.

1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học của cây đậu tƣơng

Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân,

lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có

nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm

của không khí tạo thành đạm dễ tiêu [4]. Các công trình nghiên cứu cho thấy

những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho hàm

lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất. Thân

cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, lá đậu tương là lá kép với 3

lá chét, nhưng đôi khi cũng có 4-5 lá chét. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa

đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ

nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có

nhiều lông khi chín có màu vàng hoặc xám. Hạt đậu tương không có nội nhũ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5

mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình tròn hoặc bầu dục,

tròn dài, tròn dẹt, ovan... vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm,

xanh, nâu, đen... đa số là hạt màu vàng. Khối lượng hạt rất đa dạng dao động từ

20-400 mg/ hạt. Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu

hiện đặc trưng của giống. Cây đậu tương có 2 loại hình sinh trưởng: sinh

trưởng hữu hạn và sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia ra

nhóm chín sớm, trung bình và muộn.

Theo thời gian sinh trưởng, các nhà chọn giống đậu tương cho rằng các

giống chín rất sớm (75-90 ngày), các giống chín sớm (90-100 ngày), các

giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120

ngày), các giống chín muộn (130-140 ngày), các giống chín rất muộn (140-

150 ngày) thời gian sinh trưởng là một yếu tố rất quan trọng để lựa chọn cây

trồng luân canh xen vụ. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện

ngoại cảnh. Trong tập đoàn giống đậu tương có những giống chỉ trồng vào vụ

hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông, có những giống trồng ở vụ xuân hè

và có những giống trồng thích hợp với vụ thu đông [9].

Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu

về nước cao hơn các loại cây khác và thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Đó là do

trong hạt và cây đậu tương có hàm lượng protein và lipit rất cao, để tổng hợp

1kg chất khô cần 500 – 530 kg nước, trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về

nước của cây đậu tương cũng khá cao 50%, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%,

lúa là 20% [9].

Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên dẫn đến tình

trạng thiếu nước đặc biệt đối với thực vật. Khái niệm về hạn được dùng để chỉ

sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình hay trong từng giai

đoạn làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Những cây

trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6

trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn. Khi nghiên cứu về đặc tính

chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và di truyền đã cho thấy

rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của chất

nguyên sinh, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu hạn của cây đậu

tương là tính trạng đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: như

sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di

truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình

sinh trưởng và phát triển của cây. Căn cứ vào đặc điểm này, đậu tương được

chia thành hai nhóm:

- Nhóm chịu được mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.

- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả các giai đoạn phát triển

của cây.

1.2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG

1.2.1. Cơ sở khoa học của chọn dòng tế bào soma

Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tính toàn

năng của tế bào thực vật. Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều là

khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều này đã

được các nhà khoa học chứng minh qua nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô và tế

bào thực vật.

Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số

lượng lớn các tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể

xem như quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen,

kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay

đổi ở mức độ cơ thể. Những biến đổi di truyền tự phát xảy ra trong quá trình

nuôi cấy mô tế bào được Larkin và Scowcroft (1982) gọi là ―biến di sinh

dưỡng‖ hay ―biến dị soma‖. Giải thích về sự xuất hiện biến dị soma trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7

điều kiện in vitro có rất nhiều ý kiến khác nhau. Theo Skirvin và CS (1994),

sự xuất hiện biến dị soma có thể là sự rối loạn trong phân bào nguyên nhiễm

gây ra bởi các chất kích thích sinh trưởng hoặc sự có mặt của một số chất

trong môi trường nuôi cấy. Sự hình thành biến dị soma cũng có thể là do đột

biến về số lượng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể, sự tái tổ hợp trong phân bào

nguyên nhiễm[13], sự phát huy tác dụng của các yếu tố di truyền vận động, sự

methyl hóa ADN…[1]. Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có

khả năng tái sinh trực tiếp thành cây, ngoài ra chúng có khả năng phát triển

trực tiếp từ tế bào mô sẹo (callus).

Trong các phương thức nuôi cấy phổ biến hiện nay thì nuôi cấy mô

sẹo được nghiên cứu trên nhiều đối tượng hơn cả. Mô sẹo là loại tế bào chưa

phân hóa, phân chia liên tục, có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây

hoàn chỉnh. Mô sẹo được hình thành qua nuôi cấy in vitro từ các cơ quan sinh

dưỡng của thực vật. Trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm

auxin, điều kiện nuôi cấy thích hợp mô sẹo có thể hình thành và duy trì thông

qua cấy chuyển và tái sinh. Các mô sẹo sau khi xử lý bởi điều kiện cực đoan

thì khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên rõ rệt [35]. Nhiều nghiên cứu

cho thấy, cây tái sinh từ mô sẹo có những biến đổi di truyền phong phú [16].

Tuy nhiên, với mỗi loại cây nhất thiết phải nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tối

ưu thích hợp cho việc đánh giá hoặc tái sinh cây. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng

tới khả năng tái sinh của cây như nguồn gốc mô sẹo [23], mức bội thể của mô

sẹo, thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ

sung vào môi trường nuôi cấy. Theo Lê Trần Bình và CS (1995) dưới tách

động của điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất định những mô

hay tế bào thường chết, những tế bào có sức sống mới sống sót và cho hiệu

quả tái sinh cao [3]. Để đạt được hiệu quả trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô

sẹo người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau nhằm