Phát hiện và phân biệt chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn bằng phương pháp Multiplex RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU

PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT CHỦNG VIRUS GÂY

HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX RT-PCR (REVERSE

TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU

PHÁT HIỆN VÀ PHÂN BIỆT CHỦNG VIRUS GÂY

HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX RT-PCR (REVERSE

TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION)

Chuyên ngành : Động Vật Học

Mã số : 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY

Hà Nội – 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các

kết quả nêu trong Luận văn chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào

khác. Các số liệu, ví dụ và trích dẫn trong Luận văn đảm bảo tính chính xác,

tin cậy và trung thực. Tôi đã hoàn thành tất cả các môn học và đã thanh toán

tất cả các nghĩa vụ tài chính theo quy định của Phòng Đào tạo sau Đại học,

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật.

Vậy tôi viết Lời cam đoan này đề nghị Phòng Đào tạo sau Đại học,

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật xem xét để tôi có thể bảo vệ Luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

NGƢỜI CAM ĐOAN

Nguyễn Thị Thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Diệu

Thúy, Phó trưởng phòng Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và truyền

đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ chỉ bảo tận tình về

chuyên môn và sự động viên chân thành của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng

Công nghệ gen động vật, Viện Công nghệ sinh học.

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô Phòng Đào tạo sau đại

học - Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều

kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên,

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày… tháng … năm 2013

Học Viên

NGUYỄN THỊ THU

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................I

LỜI CẢM ƠN......................................................................................................... IV

MỤC LỤC.................................................................................................................V

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT....................................... VI

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. VIII

DANH MỤC CÁC HÌNH...................................................................................... IX

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

NỘI DUNG ................................................................................................................3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3

1.1. Khái quát về hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS - Porcine

reproductive and respiratory syndrome)................................................................3

1.1.1. Sự xuất hiện và phát sinh dịch bệnh của bệnh PRRSV.................................3

1.1.2. Triệu chứng lâm sàng ....................................................................................6

1.1.3. Tác hại của bệnh ............................................................................................7

1.1.4. Đƣờng truyền lây của virus............................................................................8

1.2. Tổng quan về virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory

syndrome virus).........................................................................................................8

1.2.1. Đặc điểm của virus ........................................................................................8

1.2.2. Cấu trúc virus.................................................................................................9

1.2.3. Chức năng của ORFs..................................................................................11

1.2.4. Đặc tính vai trò của Protein chức năng N....................................................13

1.3. Các phƣơng pháp phát hiện PRRSV..............................................................14

1.3.1.Biểu hiện lâm sàng........................................................................................14

1.3.2. Phân lập virus...............................................................................................15

1.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học ....................................................15

1.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa trên nguyên lý PCR (RT-PCR và realtime RT￾PCR).......................................................................................................................16

1.4. Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới và Việt Nam............................22

1.4.1. Tình hình nghiên cứu PRRSV trên thế giới.................................................22

1.4.2. Tình hình nghiên cứu PRRSV ở Việt Nam .................................................25

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................29

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................29

2.2. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.2.1. Mồi sử dụng.................................................................................................29

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất.......................................................................30

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................31

2.3.1. Tách RNA tổng số .......................................................................................31

2.3.2. Phƣơng pháp thiết kế mồi............................................................................31

2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR.................................................................................32

2.3.4. Tinh sạch đoạn ORF7 để giải trình tự .........................................................33

2.3.5. Phân tích trình tự gen và amino acid tƣơng ứng của các chủng PRRSV ....34

2.3.6. Xác định độ đặc hiệu.....................................................................................34

2.3.7. Xác định độ nhậy...........................................................................................34

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................37

3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số......................................................................37

3.2. Kết quả nhân đoạn gen ORF7 ........................................................................37

3.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen ORF7 ............................................................38

3.3.1. So sánh sự khác nhau về trình tự nucleotide của ORF7..............................38

3.3.2.2. So sánh sự khác nhau về thành phần amino acid của ORF7 ....................43

3.3.2.3.So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide và thành phần amino

acid của đoạn gen ORF7........................................................................................46

3.3.2.4. Phân tích cây phả hệ của PRRSV ở đoạn gen ORF7 ...............................50

3.4. Thiết kế mồi và kiểm tra độ nhậy của PRRSV..............................................52

3.5. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của PRRSV.....................................................54

3.6. Kết quả kiểm tra độ nhậy của PRRSV ..........................................................55

3.6.1. Kết quả kiểm tra độ nhậy.............................................................................55

3.6.2. Kết quả chẩn đoán dựa vào phƣơng pháp mRT-PCR .................................56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................................59

Kết luận....................................................................................................................59

Đề nghị......................................................................................................................59

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .........60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................61

PHỤ LỤC.................................................................................................................70

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

RNA Ribonucleic acid Axit Ribonucleic

bp Base paire Cặp bazơ

cs Cộng sự

aa Amino acid Axit amin

nt Nucleotide Nucleotit

dNTP Deoxyribonucleic acid triphosphate Deoxynucleosit triphotphat

LB Loading buffer Đệm tra mẫu

n Number Số lƣợng mẫu

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RT-PCR

Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction

Phản ứng chuỗi đồng phân hóa

sao chép ngƣợc

mRT￾PCR

Multiplex Reverse Transcription

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng nhiều chuỗi đồng phân

hóa sao chép ngƣợc

ORF Open reading frame Khung đọc mở

NA North American type Kiểu Bắc Mỹ

EU European type Kiểu Châu Âu

Nsp non-structural protein Protein không cấu trúc

NLS nuclear localization signal Vùng tín hiệu định vị nhân

NoLS nucleolar localization signal Vùng tín hiệu định vị hạch nhân

PRRS Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô

hấp ở lợn

PRRSV

Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome Virus

Virus gây hội chứng rối loạn sinh

sản và hô hấp ở lợn

PCV2 Porcine Circovirus type 2 Virus Ciro loại 2

CSFV Classical swine fever virus Virus sốt cổ điển lợn

RNase Ribonuclease Ribonucleaza

TE Tris boric acid - EDTA Đệm TE

µg Microgram Mi – cro – gam

µl Microlitre Mi – cro – lít