Phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) chuyển gen GSI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DÒNG

BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ HUYỀN

PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DÒNG

BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1

Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. BÙI VĂN THẮNG

Hà Nội - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Đây là công trình nghiên cứu của tôi và cùng cộng tác với các cộng sự

khác;

- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho

phép của các đồng tác giả;

- Phần kết quả còn lại của luận văn chưa được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Huyền

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Văn Thắng, Viện trưởng

Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống

Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển

gen” là người thầy đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ kinh phí và các điều kiện cần

thiết khác để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Việt, Chủ nhiệm Bộ môn

Công nghệ tế bào và toàn thể các cán bộ thuộc Bộ môn đã tạo những điều kiện

thuận lợi để tôi được học tập, thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn.

Trong quá trình làm luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của

toàn thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm

nghiệp. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn

động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận

văn này.

Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Huyền

iii

MỤC LỤC

Trang

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................ii

MỤC LỤC............................................................................................................iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ vi

DANH MỤC CÁC BÀNG..................................................................................vii

DANH MỤC CÁC HÌNH..................................................................................viii

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN.......... x

MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4

1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn Urô nói riêng ..................... 4

1.2. Một số nghiên cứu chuyển gen vào Bạch đàn ............................................... 7

1.3. Gen GS1 và kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây trồng ................ 10

1.4. Vector chuyển gen GS1 vào cây bạch đàn Urô ........................................... 15

1.5. Các phương pháp phân tích đánh giá cây chuyển gen ở phòng thí nghiệm và

đồng ruộng........................................................................................................... 18

1.5.1. Đánh giá chọn lọc cây chuyển gen in vitro và in vivo.............................. 18

1.5.2. Phân tích cây chuyển bằng kỹ thuật sinh học phân tử................................ 19

1.5.3. Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển ........................................... 23

Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 25

2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 25

2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 25

2.2.1. Phân tích, xác định các dòng cây chuyển gen........................................... 25

2.2.2. Đánh giá sinh trưởng của các dòng cây chuyển gen ở giai đoạn nhà lưới 25

2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 25

2.3.1. Phương pháp sàng lọc các thể nhận gen GS1 in vitro .............................. 26

iv

2.3.2. Đánh tính kháng kháng sinh Kanamycin của các dòng cây bạch đàn Urô

chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới ....................................................................... 27

2.3.3. Phương pháp tách DNA tổng số (lượng nhỏ) từ thực vật......................... 27

2.3.4. Phương pháp tách chiết ADN tổng số (lượng lớn) từ thực vật ................. 28

2.3.5. Phương pháp định tính và định lượng DNA tổng số.................................. 29

2.3.6. Phương pháp tách chiết RNA tổng số........................................................ 30

2.3.7. Phương pháp tách chiết mRNA ................................................................. 30

2.3.8. Phương pháp tổng hợp cDNA................................................................... 31

2.3.9. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen

bằng PCR............................................................................................................. 33

2.3.10. Phương pháp Southern blot..................................................................... 35

2.3.11. Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR).............................. 36

2.3.12. Phương pháp nhân giống vô tính các dòng bạch đàn Urô........................ 37

2.3.13. Đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn chuyển gen GS1.............. 38

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 39

3.1. Kết quả sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trên môi trường kháng

sinh chọn lọc in vitro........................................................................................... 39

3.2. Kết quả sàng lọc các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 in vivo ............. 42

3.3. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kỹ thuật

PCR ..................................................................................................................... 45

3.4. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật lai

Southern............................................................................................................... 48

3.5. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật

RT-PCR............................................................................................................... 49

3.6. Kết quả đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển trong các dòng bạch đàn

Urô chuyển gen GS1 ........................................................................................... 51

3.7. Kết quả đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS155

3.7.1. Sinh trưởng về chiều cao của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1

trồng trong nhà lưới............................................................................................. 55

v

3.7.2. Đánh giá sinh khối tươi của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 và

đối chứng giai đoạn vườn ươm ........................................................................... 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

BAP 6-Benzylaminopurine

cDNA Complementary DNA

CS. Cộng sự

DNA Axic deoxiribonucleic

E. Eucalyptus

FAO

Food and Agriculture Organization of the United

Nations

GS Glutamin synthetase

IBA Indol Butyric Acid

Kan Kanamycin

MS Murashige & Skoog

NAA Napthalene Acetic Acid

MT Môi trường

NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

RNA Riboucleic acid

RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction

WT Wild type (hoang dại)