Phân Lập Một Số Chủng Nấm Hại Gỗ Và Xác Định Khả Năng Kháng Nấm Của Gỗ Keo Biến Tính

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề tài nghiên cứu khoa học, cùng

với sự nỗ lực của bản thân, chúng tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của cơ sở đào tạo

là Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, đơn vị trực tiếp giảng dạy chuyên

môn, hỗ trợ chúng tôi về nhân lực, cơ sở vật chất và điều kiện thí nghiệm.

Chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn về sự quan tâm, giúp đỡ quý báu đó.

Nhân dịp này, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Vũ Kim Dung

là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên cứu, truyền đạt kiến thức

chuyên môn và phƣơng pháp nghiên cứu để chúng tôi hoàn thành tốt đề tài. Xin

đƣợc chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Hồng Nhung đã dành nhiều thời gian,

công sức, truyền cho chúng tôi nhiệt huyết và kinh nghiệm phong phú trong suốt

thời gian chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu khoa học.

Chúng tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến toàn bộ quý thầy cô phòng

bộ môn Vi sinh – Hóa sinh cùng toàn thể tập thể cán bộ Viện Công nghệ sinh

học Lâm Nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi về phƣơng tiện, hƣớng dẫn chúng tôi

trong suốt quá trình tiến hành đề tài. Đồng thời xin cảm ơn sự giúp đỡ về mặt

vật chất và tinh thần từ bạn bè và gia đình, những ngƣời đã khích lệ, hỗ trợ

chúng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Do kiến thức chuyên môn còn hạn hẹp nên không tránh khỏi những thiếu

sót, chúng tôi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy

cô giáo, cũng nhƣ các bạn sinh viên để nghiên cứu khoa học của chúng tôi đƣợc

hoàn thiện hơn.

Chúng tôi xin chân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 07 tháng 5 năm 2019

ii

M

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................i

M C C.............................................................................................................ii

DANH M C CÁC BẢNG...................................................................................iv

DANH M C CÁC HÌNH .................................................................................... v

ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU ......................................................... 2

1.1. Khái quát về nấm hại gỗ ............................................................................... 2

1.1.1. Khái niệm.................................................................................................. 2

1.1.2. Phân loại nấm hại gỗ................................................................................. 2

1.1.3. Tác hại của nấm hại gỗ.............................................................................. 3

1.2. Hệ enzym thủy phân của nấm mục gỗ .......................................................... 5

1.2.1. Cấu tạo và tính chất của ligno-cellulose ................................................... 5

1.2.2. Hệ enzym thủy phân lignin ....................................................................... 7

1.2.3. Hệ enzym thủy phân cellulose .................................................................. 8

1.3. Một số loại nấm hại gỗ điển hình.................................................................. 9

1.3.1. Nấm mục trắng.......................................................................................... 9

1.3.2. Nấm mục nâu .......................................................................................... 11

1.3.3. Nấm biến màu ......................................................................................... 12

1.4. Định danh nấm bằng phƣơng pháp hiện đại ............................................... 14

1.4.1. Khái niệm................................................................................................ 14

1.4.2. Một số đặc điểm vùng phiên mã trong ITS – rDNA của nấm mục ........ 14

1.5. Khái quát về gỗ keo biến tính ..................................................................... 15

1.5.1. Khái niệm về biến tính gỗ ....................................................................... 15

1.5.2. Các phƣơng pháp biến tính gỗ keo.......................................................... 16

1.5.3. Vai trò của gỗ biến tính........................................................................... 17

1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc................................................. 17

1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.......................................................... 17

1.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .......................................................... 18

iii

CHƢƠNG II: NỘI DUNG – M C TIÊU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 21

2.1. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................... 21

2.1.1. Mục tiêu chung........................................................................................ 21

2.1.2. Mục tiêu cụ thể........................................................................................ 21

2.2. Nội dung nghiên cứu................................................................................... 21

2.2.1. Phân lập một số chủng nấm hại gỗ ......................................................... 21

2.2.2. Xác định khả năng kháng nấm của gỗ keo biến tính .............................. 21

2.3. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 21

2.3.1. Mẫu nấm.................................................................................................. 21

2.3.2. Mẫu gỗ..................................................................................................... 21

2.3.3. Hóa chất, thiết bị ..................................................................................... 22

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................. 23

2.4.1. Phƣơng pháp phân lập và sàng lọc.......................................................... 23

2.4.2. Phƣơng pháp xác định khả năng kháng nấm của gỗ keo biến tính......... 24

2.4.3. Phƣơng pháp định tên nấm bằng kĩ thuật sinh học phân tử.................... 26

2.4.4. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu.................................................... 27

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN......................... 28

3.1. Kết quả phân lập một số chủng nấm hại gỗ................................................ 28

3.1.1. Phân lập và tuyển chọn nấm mục............................................................ 28

3.1.2. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học ..................................................... 34

3.1.3. Kết quả định tên nấm .............................................................................. 41

3.2. Kết quả xác định khả năng kháng nấm của hai loại gỗ keo biến tính......... 44

3.2.1. Kết quả xác định khả năng kháng nấm của gỗ keo biến tính nano......... 44

3.2.2. Kết quả xác định khả năng kháng nấm của gỗ Keo biến tính nhiệt........ 49

KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ ............................................................ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

iv

DANH M C CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các thông số kĩ thuật của mẫu gỗ keo biến tính nhiệt....................... 22

Bảng 3.1: Kết quả phân lập nấm mục ................................................................. 29

Bảng 3.2: Kết quả tuyển chọn nấm mục trắng và nấm mục nâu ........................ 33

Bảng 3.3: Đƣờng kính khuẩn lạc nấm trên các loại môi trƣờng khác nhau ....... 34

Bảng 3.4: Đƣờng kính khuẩn lạc nấm ở điều kiện pH khác nhau ...................... 36

Bảng 3.5: Đƣờng kính vòng phân giải cơ chất (cm) của các chủng nấm........... 38

Bảng 3.6: Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng 28S rARN từ chủng L4 với các

trình tự tƣơng đồng ở GeneBank......................................................................... 43

Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm mục trắng L4 của gỗ keo

biến tính nano ...................................................................................................... 45

Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm mục nâu M1 của gỗ keo

biến tính nano ...................................................................................................... 46

Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm biến màu Aspergillus niger

của gỗ Keo biến tính nano................................................................................... 48

Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm mục trắng của gỗ Keo biến

tính nhiệt.............................................................................................................. 50

Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm biến màu của gỗ keo biến

tính nhiệt.............................................................................................................. 54

v

DANH M C CÁC HÌNH

Hình 1.1: Nấm biến màu (A); nấm mục trắng (B); nấm mục nâu (C).................. 3

Hình 1.2: Tác hại của nấm hại gỗ ......................................................................... 4

Hình 1.3: Thành phần cấu trúc của phân tử ligno-cellulose ................................. 5

Hình 1.4: Cấu tạo phân tử cellulose ...................................................................... 6

Hình 1.5: Cấu trúc của hemicellulose ................................................................... 7

Hình 1.6: Cấu trúc phân tử lignin.......................................................................... 7

Hình 1.7: Một số loại enzym ligninase ................................................................. 8

Hình 1.8: Quá trình phân giải cellulose của cellulase........................................... 9

Hình 1.9: Nấm Sò trên gỗ mục............................................................................ 10

Hình 1.10: Nấm Vân chi trên gỗ mục ................................................................. 11

Hình 1.11: Nấm Coniophora puteana trên gỗ mục ............................................. 11

Hình 1.12: Nấm Serpula lacrymans.................................................................... 12

Hình 1.13: Nấm Aspergillus niger ...................................................................... 13

Hình 1.14: Nấm Penicillium ............................................................................... 13

Hình 1.15: Sơ đồ vùng ITS – rDNA của nấm..................................................... 15

Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện đƣờng kính khuẩn lạc nấm (cm) trên các môi trƣờng

khác nhau............................................................................................................. 35

Hình 3.2: Khuẩn lạc nấm M1 trên các loại môi trƣờng khác nhau..................... 35

Hình 3.3: Khuẩn lạc nấm L4 trên các loại môi trƣờng khác nhau...................... 36

Hình 3.4: Biểu đồ thể hiện đƣờng kính khuẩn lạc nấm (cm) trên điều kiện pH

khác nhau............................................................................................................. 37

Hình 3.5: Khuẩn lạc nấm M1 ở điều kiện pH khác nhau................................... 37

Hình 3.6: Khuẩn lạc nấm L4 ở điều kiện pH khác nhau..................................... 38

Hình 3.7: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng nấm M1 trên cơ chất acid

tanic (hình a); CMC (hình b); tinh bột (hình c)................................................... 39

Hình 3.8: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng nấm 1 trên cơ chất acid

tanic (hình a); CMC (hình b); tinh bột (hình c)................................................... 40

vi

Hình 3.9: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng nấm 2 trên cơ chất acid

tanic (hình a); CMC (hình b); tinh bột (hình c)................................................... 40

Hình 3.10: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng nấm 3 trên cơ chất acid

tanic (hình a); CMC (hình b); tinh bột (hình c)................................................... 40

Hình 3.11: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng nấm 4 trên cơ chất acid

tanic (hình a); CMC (hình b); tinh bột (hình c)................................................... 40

Hình 3.12: Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng nấm 5 trên cơ chất acid

tanic (hình a); CMC (hình b); tinh bột (hình c)................................................... 41

Hình 3.13: Kết quả tra cứu trên Blast NCBI....................................................... 42

Hình 3.14: Mẫu gỗ phủ nano trên môi trƣờng cấy nấm L4 sau 2 tuần............... 46

Hình 3.15: Mẫu gỗ phủ nano trên môi trƣờng cấy nấm L4 sau 4 tuần............... 46

Hình 3.16: Mẫu gỗ phủ nano trên môi trƣờng cấy nấm M1 ............................... 47

Hình 3.17: Mẫu gỗ phủ nano trên môi trƣờng chứa nấm A. niger ..................... 49

Hình 3.18: Mẫu gỗ Keo biến tính nhiệt trên môi trƣờng cấy nấm Pleurotus

ostreatus sau 2 tuần ............................................................................................. 51

Hình 3.19: Mẫu gỗ Keo biến tính nhiệt trên môi trƣờng cấy nấm Pleurotus

ostreatus sau 4 tuần ............................................................................................. 51

Hình 3.20: Mẫu gỗ keo biến tính nhiệt trên môi trƣờng cấy nấm mục nâu........ 53

Hình 3.21: Thử nghiệm khả năng kháng nấm biến màu A. niger trên gỗ biến tính

nhiệt trong 2 tuần và 4 tuần................................................................................. 55

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngành công nghiệp chế biến gỗ của Việt Nam

đã có những bƣớc phát triển vƣợt bậc. Sản phẩm gỗ xuất khẩu của Việt Nam đã

có mặt trên thị trƣờng của 120 nƣớc trên thế giới, kim ngạch xuất khẩu các sản

phẩm về gỗ năm 2018 đạt 9,3 tỉ USD. Gỗ đƣợc xếp là một trong những mặt

hàng xuất khẩu chủ lực và đƣợc xếp vào 16 loại mặt hàng xúc tiến thƣơng mại

quốc gia.

Bên cạnh các phƣơng pháp bảo quản gỗ thông thƣờng là sử dụng các loại

thuốc phòng ngừa và diệt nấm hại gỗ thì phƣơng pháp biến tính gỗ mang đến

giải pháp hữu hiệu nhằm nâng cao độ bền cơ học và cải thiện khả năng chống

nấm cho gỗ mà không gây độc hại cho môi trƣờng. Ở Việt Nam, Keo và Bạch

đàn là loại cây lâm nghiệp rất phổ biến, chiếm hơn 70% diện tích rừng trồng.

Thống kê cho thấy có hơn 80% vật liệu gỗ sử dụng cho các ngành công nghiệp

đều đƣợc xử lí bằng các phƣơng pháp biến tính khác nhau, chủ yếu là các loại gỗ

Keo và Bạch đàn. Trong đó biến tính gỗ bằng nano và biến tính nhiệt là hai

phƣơng pháp biến tính gỗ đƣợc sử dụng phổ biến nhất để nâng cao cƣờng độ cơ

học cũng nhƣ khả năng kháng nấm gây hại gỗ.

Các loại nấm mục, nấm biến màu là một trong những tác nhân gây hại

mạnh gây ra thiệt hại nghiêm trọng về giá trị của gỗ trong quá trình sử dụng,

chúng làm giảm khối lƣợng gỗ, cƣờng độ cơ học của gỗ và gây biến màu bề mặt

gỗ làm giảm chất lƣợng thẩm mỹ của gỗ. Do đó việc phân lập, nghiên cứu các

đặc tính của một số chủng nấm hại gỗ và đánh giá mức độ gây hại của một số

chủng nấm gây tác động lớn đến vật liệu gỗ biến tính trƣớc khi sử dụng là vấn

đề cấp thiết.

Tuy nhiên, ở nƣớc ta chƣa có nhiều công bố về phân lập nấm hại gỗ và

đánh giá khả năng kháng nấm của gỗ biến tính, đặc biệt là gỗ keo. Điều này ảnh

hƣởng rất lớn đến việc đƣa ra các tiêu chuẩn đánh giá chất lƣợng của gỗ biến

tính và vấn đề thƣơng mại hóa đồ gỗ xuất khẩu, làm hạn chế tiềm năng sử dụng

gỗ biến tính. Nhằm mục đích tạo đƣợc một bộ chủng nấm hại gỗ ứng dụng cho

việc đánh giá khả năng kháng nấm của gỗ biến tính chúng tôi thực hiện nghiên

cứu đề tài: “Phân lập một số chủng nấm hại gỗ và xác định khả năng kháng

nấm của gỗ keo biến tính”.

2

HƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về nấm hại gỗ

1.1.1. Khái niệm

Nấm là khái niệm chung chỉ giới sinh vật sống chủ yếu theo phƣơng thức

dị dƣỡng, không có chất diệp lục, có nhân thật, có thành tế bào chứa kitin￾glucan, có khả năng phân hủy chất hữu cơ, phát triển ở dạng đa bào hoặc đơn

bào. Những đại diện tiêu biểu của nấm bao gồm nấm mốc, nấm men và nấm lớn

(nấm quả thể) [4].

Nấm sinh sản chủ yếu bằng hình thức sinh bào tử (bào tử vô tính hoặc

hữu tính) và sinh sản sinh dƣỡng bằng cách tách rời một phần hệ sợi. Hiện nay

các nghiên cứu đã phát hiện đƣợc hơn 10000 loài nấm trong tự nhiên [11].

Nấm có vai trò vô cùng quan trọng, bên cạnh lợi ích của nấm là phân hủy chất

hữu cơ, làm thức ăn, dƣợc liệu, sản xuất các chất có hoạt tính sinh học… nấm còn

đƣợc biết đến là tác nhân gây bệnh cho động thực vật và con ngƣời [21].

Những loài nấm có khả năng phân hủy đƣợc một hay nhiều cấu tử của gỗ

nhƣ cellulose, hemicellulose, lignin gây ra hiện tƣợng mục gỗ đƣợc gọi là nấm

hại gỗ. Nấm hại gỗ có thể xâm nhập trên gỗ đã chặt hạ hoặc sống kí sinh trên

cây lâm nghiệp làm giảm năng suất gỗ. Gỗ khi bị nấm mục tấn công sẽ bị thay

đổi màu sắc, giảm khối lƣợng và gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các tính chất

cơ lí chịu lực của gỗ. Cùng với côn trùng hại gỗ (mối, mọt, sâu đục thân…) nấm

mục gỗ làm giảm tuổi thọ của các công trình, ảnh hƣởng đến năng suất cây

trồng, gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế cho ngành chế biến lâm sản và các ngành

công nghiệp khác liên quan [12, 39].

1.1.2. Phân loại nấm hại gỗ

Nấm hại lâm sản rất đa dạng, thuộc nhiều lớp, nhiều bộ khác nhau. Kết

quả điều tra khảo sát ban đầu về nấm hại gỗ của Viện điều tra quy hoạch lâm

nghiệp ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam đã phát hiện khoảng 100 loài nấm hại gỗ,

trong đó có 25 - 30 loài có tán nấm thu đƣợc trên những cây gỗ chết. Nấm hại gỗ

sau chặt hạ tại các kho bãi đƣợc thống kê thuộc 3 lớp, 7 bộ, 11 họ, 21 chi và 55

loài [18].