Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ ĐÌNH CHẮC

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU

KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT

CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ ĐÌNH CHẮC

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU

KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT

CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN

2. GS.TSKH. NGUYỄN TÀI LƯƠNG

THÁI NGUYÊN - 2013

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới PGS.TS. Lê Quang

Huấn – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; GS.TSKH. Nguyễn Tài

Lương, là những người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo mọi điều kiện

thuận lợi nhất, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian

thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Di truyền và Sinh học

hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học Sư phạm Đại học

Thái Nguyên. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Phòng Quản lý Sau đại học và Ban

lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.

Tôi cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức đã tạo điều

kiện cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ quý báu của tất cả các

anh, chị em và các bạn phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Cuối cùng, tôi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả người thân trong gia

đình đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi

hoàn thành luận án này!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

NCS. Lê Đình Chắc

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả là đồng tác giả với

các cộng sự khác.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần cũng

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho

phép của các đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu

nào khác.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

Tác giả

Lê Đình Chắc

iii

MỤC LỤC

Mục Tên chương, phần, mục và tiểu mục Trang

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục hình ix

Danh mục bảng xii

Mở đầu 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư 4

1.1.1. Nguồn gốc tế bào ung thư 4

1.1.2. Đặc điểm của tế bào ung thư 6

1.1.3 Ung thư phổi 7

1.2. Kháng nguyên CYFRA21-1 12

1.2.1. Cytokeratin 12

1.2.2. Cấu trúc của Cytokeratin 15

1.2.3. Biểu hiện của Cytokeratin 15

1.2.4. Kháng nguyên CYFRA21-1 17

1.3. Kháng thể 21

1.3.1. Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và

thực tiễn hiện nay

21

1.3.2. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 29

1.4. Công nghệ phage display 30

1.4.1. Giới thiệu công nghệ phage display 30

1.4.2. Ứng dụng của kháng thể phage-scFv trong chẩn đoán và

điều trị

31

iv

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1. Vật liệu 33

2.1.1. Mẫu bệnh phẩm 33

2.1.2. Sinh phẩm và hóa chất 33

2.1.3. Trang thiết bị 35

2.1.4. Phần mềm máy tính 36

2.2. Phương pháp 37

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 37

2.2.2. Các phương pháp thao tác với DNA 38

2.2.3. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 45

2.2.4. Các kỹ thuật phage display 48

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55

3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng

nguyên CYFRA21-1

55

3.1.1. Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi 55

3.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1 57

3.1.3. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 58

3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 62

3.2. Biểu hiện và thu kháng nguyên CYFRA21-1 64

3.2.1. Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 64

3.2.2. Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên

CYFRA21-1

66

3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện pET-21a(+)/Cyfra21-1 67

3.2.4. Biểu hiện protein CYFRA21-1 tái tổ hợp 72

3.2.5. Tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1 74

3.2.6. Kết quả phân tích khối phổ protein tái tổ hợp 75

v

3.3. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1 77

3.4. Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 81

3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương và lách của gà đã

được gây miễn dịch

81

3.4.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà

đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1

81

3.4.3. Quy trình tạo dòng phage biểu hiện kháng thể scFv

(kháng thể phage)

85

3.4.4. Kết quả chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng

nguyên CYFRA21-1

86

3.4.5. Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu epitope

kháng nguyên CYFRA21-1

89

3.5. Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu

được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1

91

3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh

phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

97

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 101

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 103

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AML Acute Myelogenous Leukemia

Amp Ampicillin

APS Amoniumpersulphate

cDNA complement DNA

CDR Complement Determining Region

CEA Carcinoembryonic Antigen

CLL Chronic lymphocytic leukemia

ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate

DEPC Diethyl Procarbonate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EtBr Ethidium Bromide

FcR Frament cristallisable Recetor

FDA Food and Drug Administration

HCDM Human Cell Differentiation Molecules

HCL Hairy cell leukemia

HL Hodgkin Lymphoma

HLDA Human Leukocyte Differentiation Antigens

HRP horseradish peroxidase

vii

HT Huyết thanh

IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside

KN Kháng nguyên

Jak Janus tyrosine kinase

LAK Lymphokine activated killer

LB Luria Betani

mAb Monoclonal Antibody

MPBS skimmed milk in PBS

NHL Non-Hodgkin lymphoma

NK Natural Killer

NES Neuron specific enolase

NRE Negative Regulatory Element

NSCLC Non small cell lung carcinoma

OD Optical Density

PASI Psoriasis Area and Severity Index

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PD-IPCR Phage display-IPCR

PEG Polyetylene Glycol

PRR Positive Regulation Region

RT-PCR Revert Transcriptase - Polymerase Chain Reaction

viii

scFv Single chain variable fragment

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SCLC Small cell lung carcinoma

TAE Tris - Acetate - EDTA

TE Tris - EDTA

TEMED N, N, N’, N’ tetramethylethane-1,2-diamine

TMB 3, 3’, 5, 5’ tetramethyl benzidine

TPA Tissue polypeptide antigen

TPBS Tween 20 in PBS

TPS Tissue polypeptide specific antigen

VH immunoglobulin heavy chain variable region

VL immunoglobulin light chain variable region

X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- β - D-galactopyranoside

UTP Ung thư phổi

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

Hình 1.1. Mô hình bộ khung xương tế bào 14

Hình 1.2. Mô tả cấu trúc của Cytokeratin 15

Hình 1.3. Cấu trúc gen mã hóa Cytokeratin 19 17

Hình 1.4. Vị trí CYFRA21-1 trên Cytokeratin 19 18

Hình 1.5. Cấu trúc cơ bản của một phân tử Ig và các mảnh

kháng thể

24

Hình 1.6. Cấu trúc của phage mang gen mã hóa scFv 27

Hình 1.7. Kháng thể phage-scFv tham gia phản ứng

định lượng kháng nguyên

31

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng

real time -PCR

53

Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 58

Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách chiết plasmid tái

tổ hợp mang đoạn gen mã hóa CYFRA21-1

60

Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách dòng đoạn gen mã

hóa CYFRA21-1

61

Hình 3.4. Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn

của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1

62

Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của đoạn

gen mã hóa CYFRA21-1 thu được với trình tự amino

acid của kháng nguyên CYFRA21-1 đã được công bố

trong Ngân hàng dữ liệu quốc tế mang mã số K1C19-

HUMAN P08727

63

Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 65

Hình 3.7. Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn 66

x

mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1

Hình 3.8. Hình ảnh điện di vector tái tổ hợp cắt với hai enzym

Nde I và Xho I

68

Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector pET-21a(+) với

enzym Nde I và Xho I

69

Hình 3.10. Sơ đồ quá trình gắn kết và chọn dòng vector pET￾21a(+)/Cyfra21-1

70

Hình 3.11. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của

gen Cyfra 21-1 sau khi gắn vào vector biểu hiện

pET-21a(+)

71

Hình 3.12. Hình ảnh điện di protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli 73

Hình 3.13. Hình ảnh điện di kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp trên

cột Ni-NTA

74

Hình 3.14. Kết quả phân tích khối phổ của sản phẩm gen biểu hiện

trong E.coli sau khi cảm ứng với IPTG

75

Hình 3.15. Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA

sau khi gây miễn dịch lần thứ 3

78

Hình 3.16. Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA

trước khi lấy tuỷ xương và lách

80

Hình 3.17. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR 82

Hình 3.18. Sơ đồ vector pHEN2 83

Hình 3.19. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nối ghép VH-VL

tạo scFv

84

Hình 3.20. Kết quả chọn các dòng mang kháng thể đặc hiệu epitope

kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật ELISA

88

xi

Hình 3.21. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của

kháng thể scFv đặc hiệu epitope kháng nguyên

CYFRA21-1

89

Hình 3.22. Biểu đồ đánh giá liên kết của dòng phage 10 với huyết

thanh UTP và huyết thanh bình thường

90

Hình 3.23. Sơ đồ mồi, mẫu dò và đoạn DNA được khuếch đại trong

phản ứng định lượng kháng nguyên CYFRA21-1

93

Hình 3.24. Sơ đồ mô tả chu trình nhiệt trong phản ứng

real time PCR

93

Hình 3.25. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết

thanh, kháng nguyên

94

Hình 3.26. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết

thanh do Bệnh Viện Quân Y 108 cung cấp

96

Hình 3.27. Kết quả định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong các

mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

97

xii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng RT-PCR 39

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector

pCR2.1

40

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR 44

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng real time-PCR 54

Bảng 3.1. Kết quả thực tế nhận được sau khi phân tích khối phổ 76

Bảng 3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi

gây miễn dịch lần thứ 3

78

Bảng 3.3. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA

trước khi lấy tuỷ xương và lách

79

Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc, lựa chọn các dòng biểu lộ kháng thể đặc

hiệu quyết định kháng nguyên CYFRA21-1

88

Bảng 3.5. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết

thanh, kháng nguyên

95

Bảng 3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm

do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

98