Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng IgY nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

MAI THỊ THU

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA

DÒNG IgY NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN

NANG F1 CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH YERSINIA

PESTIS VÀ

ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 11/2017

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu là do tôi tự thực hiện.

Tất cả các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn

là hoàn toàn trung thực, chưa được bất kỳ tác giả nào công bố trước đây.

Nếu lời cam đoan không đúng sự thật tôi xin chịu hoàn toàn trách

nhiệm.

Tác giả

Mai Thị Thu

3

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ

thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách

Khoa Hà Nội người thầy đã luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên

sinh vật/Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cấp Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học,

Viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn

Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài:“Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi

khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi

hoàn thành luận văn của mình.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ

tôi trong suốt thời gian qua!

Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017

Học viên

Mai Thị Thu

4

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ......................................................................7

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT......................................................................9

LỜI MỞ ĐẦU.........................................................................................................10

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN...................................................................................12

I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch ...........................................12

I.1. Bệnh dịch hạch...................................................................................................12

I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam .................................................13

I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới....................................................................13

I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam...................................................................14

I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch ............................................................................16

I.3.1. Dịch hạch thể hạch..........................................................................................16

I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết....................................................................18

I.3.3. Dịch hạch thể phổi ..........................................................................................19

I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis.........................................20

I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch...................................................................20

I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis..........................................................22

I.5. Kháng nguyên nang F1 ......................................................................................24

I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên nang F1 ....................................................................24

I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1 .............................................................25

I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn

Y.pestis......................................................................................................................25

I.6.1. Phương pháp miễn dịch .................................................................................25

I.6.2. Phương pháp sinh học phân tử........................................................................30

I.7. Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng...........................................................31

I.7.1. Định nghĩa IgY ...............................................................................................31

I.7.2. Sự hình thành kháng thể IgY ở gà ..................................................................31

I.7.3. Cấu trúc của kháng thể IgY ............................................................................32

5

I.8. Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c ...........................33

I.8.1. Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng ..............................................33

I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng.......................................................34

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................37

II.1. Vật liệu nghiên cứu...........................................................................................37

II.1.1. Động vật thí nghiệm......................................................................................37

II.1.2. Hóa chất và vật tư tiêu hao ............................................................................37

II.1.3. Thiết bị...........................................................................................................37

II.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................38

II.2.1. Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1 ...................................................38

II.2.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng...42

II.2.3. Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1.......45

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................47

III.1. Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà ................................................47

III.1.1. Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding protein)

làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA.....................................................................47

III.1.2. Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1 ..................49

III.2. Tạo dòng tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên

chuột BALB/c thuần chủng......................................................................................53

III.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột BALB/c thuần chủng............................53

III.2.2. Kết quả tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 .....................55

II.3. Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện

nhanh F1...................................................................................................................57

III.3.1. Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm. ..............................57

III.3.2. Ảnh hưởng của các loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch

thử nghiệm cố định IgY. ..........................................................................................58

III.3.3. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng.......................60

III.3.4. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm. ...............61

III. 4. Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử. .......................64

III.4.1. Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. .....64

6

III.4.2. Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. ...............65

III.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử

nghiệm......................................................................................................................65

III.4.4. Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20....................66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................67

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................68