Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

MAI THỊ THU

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA DÒNG NHẬN

BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN NANG F1 CỦA VI KHUẨN

DỊCH HẠCH YERSINIA PESTIS VÀ ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ

PHÁT HIỆN NHANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Vi Sinh vật học

Mã số: 60420103

HÀ NỘI, 2017

1

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ

thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội người thầy đã luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn

này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên

sinh vật/Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cấp Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học,

Viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn

Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài:“Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi

khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi

hoàn thành luận văn của mình.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ

tôi trong suốt thời gian qua!

Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017

Học viên

Mai Thị Thu

2

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ......................................................................5

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................7

LỜI MỞ ĐẦU...........................................................................................................8

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN...................................................................................10

I. Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch ...........................................10

I.1. Bệnh dịch hạch...................................................................................................10

I.2. Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam .................................................11

I.2.1. Tình hình dịch hạch trên thế giới....................................................................11

I.2.2. Tình hình dịch hạch tại Việt Nam...................................................................12

I.3. Biểu hiện của bệnh dịch hạch ............................................................................14

I.3.1. Dịch hạch thể hạch..........................................................................................14

I.3.2. Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết....................................................................16

I.3.3. Dịch hạch thể phổi..........................................................................................17

I.4. Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y. pestis.........................................18

I.4.1. Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch...................................................................18

I.4.2. Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y. pestis..........................................................20

I.5. Kháng nguyên nang F1......................................................................................22

I.5.1. Cấu trúc kháng nguyên nang F1 ....................................................................22

I.5.2. Tính chất của kháng nguyên nang F1.............................................................23

I.6. Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn

Y.pestis .....................................................................................................................23

I.6.1. Phương pháp miễn dịch .................................................................................23

I.6.2. Phương pháp sinh học phân tử........................................................................29

I.7. Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng...........................................................30

I.7.1. Định nghĩa IgY ...............................................................................................30

I.7.2. Sự hình thành kháng thể IgY ở gà ..................................................................30

I.7.3. Cấu trúc của kháng thể IgY ............................................................................31

I.8. Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c ...........................32

3

I.8.1. Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng ..............................................32

I.8.2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng.......................................................33

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................36

II.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................36

II.1.1. Động vật thí nghiệm......................................................................................36

II.1.2. Hóa chất và vật tư tiêu hao............................................................................36

II.1.3. Thiết bị...........................................................................................................36

II.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................37

II.2.1. Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1 ...................................................37

II.2.2. Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng...41

II.2.3. Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1.......44

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................46

III.1. Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà ................................................46

III.1.1. Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding protein)

làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA.....................................................................46

III.1.2. Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1 ..................48

III.2. Tạo dòng tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên

chuột BALB/c thuần chủng......................................................................................52

III.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột BALB/c thuần chủng............................52

III.2.2. Kết quả tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 .....................54

II.3. Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện

nhanh F1...................................................................................................................56

III.3.1. Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm. ..............................56

III.3.2. Ảnh hưởng của các loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch

thử nghiệm cố định IgY. ..........................................................................................58

III.3.3. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng.......................59

III.3.4. Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm. ...............60

III. 4. Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử........................63

III.4.1. Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm. .....63

III.4.2. Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm................64

4

III.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử

nghiệm......................................................................................................................65

III.4.4. Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20....................65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................67

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................69

5

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001

Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch

Hình 1.6: Hình ảnh Y. pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson

Hình 1.7: Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)

Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng

Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY

Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

Hình 2.1: Gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1

Hình 3.1: Phổ điện di các phân đoạn rửa giải trong quá trình tinh sạch kháng

nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1

Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP

Hình 3.3: Xác định độ pha loãng của kháng thể IgY kháng F1

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY

Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ trứng thu tại thời điểm 30, 35

ngày sau gây miễn dịch lần 1

Hình 3.6: Hiệu giá mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau khi gây miễn

dịch ở các độ pha loãng khác nhau

Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dòng có ái

lực F1

Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng

nguyên F1

Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm

Hình 3.10: Ảnh hưởng của màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử

nghiệm cố định IgY

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch

kiểm chứng

6

Hình 3.12:Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến

cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng

Hình 3.13:Ảnh hưởng của nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.15: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng chế phẩm IgY

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử

nghiệm

Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch

thử nghiệm

Hình 3.19: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng kháng thể G20 làm

kháng thể bắt cặp

Bảng 3.1: Nồng độ protein trong các phân đoạn rửa giải khi tinh sạch trên cột sắc

ký ái lực NI-NTA

Bảng 3.2: Giá

tri ̣OD 450 nm của mẫu huyết thanh chuôt trư ̣ ớc vàsau khi gây miễn

dich. ̣

Bảng 3.3: Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho