Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

viÖn c«ng nghÖ sinh häc

B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi khoa häc cÊp nhµ n−íc

Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i tæ hîp

dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th−

M∙ sè KC 04.33

Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGs, ts. tr−¬ng nam h¶i

6702

24/12/2007

hµ néi - 2007

B¸o c¸o tæng kÕt

§Ò tµi ®éc lËp cÊp Nhµ n−íc

M∙ sè: KC. 04. 33

Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i

tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th−

Chñ nhiÖm §Ò tµi: PGS. TS. Tr−¬ng nam h¶i

01 / 2005 – 06 / 2007

Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ

ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam

ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc

BỘ KHOA HỌC VIỆN KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

--------ÂÂÂ--------

Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài

NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP

DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Mã số:   KC. 04. 33

Chủ nhiệm đề tài:   PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI

Cơ quan chủ trì:   Viện Công nghệ sinh học

Cơ quan chủ quản:    Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Thời gian thực hiện:     01/2005 ‐ 06/2007

Hà Nội - 2007

Bản báo cáo viết xong ngày 15 / 12/ 2007.

Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC. 04. 33.

Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học. V.CNSH BKHCN BKHCN V.CNSH

VKHCNVN

V.CNSH

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 2

Lêi c¶m ¬n

Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu

thuộc 3 cơ quan nghiên cứu khoa học là (i) Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, (ii) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Bộ Giáo

dục và Đào tạo và (iii) Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế đã

tham gia thực hiện đề tài.

Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ

sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên và Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và

Sinh phẩm y tế đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và kinh phí cho

các tập thể cán bộ chủ trì và tham gia thực hiện đề tài này.

Chủ nhiệm và tập thể cán bộ nghiên cứu thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn

Vụ Quản lý Khoa học và Công nghệ các ngành KT-KT của Bộ Khoa học và Công nghệ

và Ban chủ nhiệm chương trình KC. 04 đã tạo điều kiện thuận lợi về kinh phí và quản

lý trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 3

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN ..................................................8

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP......9

BÀI TÓM TẮT ......................................................................................................................11

LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................................15

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC... 17

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI .........................................................17

1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư.............................................................17

1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố.........................................................................................18

1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư................................................................................19

1.1.4. Interleukin-2 và ứng dụng trong điều trị ung thư ..................................................19

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC ............................................................23

CHƯƠNG 2. LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........26

2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................26

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN ........................................................26

2.2.1 Tạo dòng gen IL-2 ..................................................................................................26

2.2.2 Tạo đột biến điểm của gen IL-2 .............................................................................26

2.2.3. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau ...........................................27

2.2.4. Nghiên cứu và tối ưu điều kiện lên men cho các chủng vi sinh vật tái tổ hợp

mang gen IL-2 .................................................................................................................27

2.2.5. Tách chiết, tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của IL-2. .......27

2.2.6. Đánh giá chất lượng IL-2 ......................................................................................27

2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................29

2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................................29

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................30

CHƯƠNG 3. NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN ............................47

3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2..............................................................................47

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2...............47

3.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1-TA ........................................48

3.1.3. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2.............................................................49

3.1.4. Kết luận .................................................................................................................50

3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2.......................................................................51

3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys125 bằng Ser125....51

3.2.2. Gây hồi biến Ser25 thành Leu25..............................................................................54

3.2.3. Kết luận .................................................................................................................58

3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU............59

3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào vi khuẩn E. coli..............................59

3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris.................................63

3.3.3. Biểu hiện gen rhIL2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris..........................65

3.3.4. Kết luận .................................................................................................................68

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 4

3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG VI SINH

VẬT TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ

THỐNG LÊN MEN 5L, 14L...............................................................................................69

3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp trong bình tam giác .............................69

3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5, 14L. ...73

3.4.3. Kết luận .................................................................................................................74

3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN

CỨU TÍNH CHẤT ..............................................................................................................75

3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực......................................................75

3.5.2. Cắt protein lai bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm

tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot..............................................76

3.5.3. Kết luận .................................................................................................................77

3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2................................................78

3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO NUÔI CẤY CTLL-2 ....79

3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL-2 .................................79

3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của các mẫu rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21 .......80

3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris...............82

3.7.4. Kết luận. ................................................................................................................83

3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT...........84

3.8.1. Kết quả nghiên cứu................................................................................................84

3.8.2. Kết luận .................................................................................................................97

3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 ...............................................................98

3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2 ..................................................................................98

3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2 ..........................................................................98

3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2 ............................................................................98

3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2 ............................................................................98

3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm ..............................................................................99

3.9.6. Kết luận .................................................................................................................99

CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC................. 100

4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC ......................................................................................100

4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ..........................102

4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ.........................................................................................104

4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG ............................................................................................104

4.5. ĐÀO TẠO ..................................................................................................................105

4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ.................................................................................................105

4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ ..........................................................................106

4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .......................................................106

4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................107

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................................110

5.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................110

5.2. ĐỀ NGHỊ....................................................................................................................111

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................112

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 5

MỤC LỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư ..................................................................................18

Hình 2. Cấu trúc không gian của Interleukin-2 ........................................................................20

Hình 3. Sự tác động của ProleukinR

IL-2 lên tế bào ung thư.....................................................23

Hình 4. Tóm tắt các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ ...............................................................28

Hình 5. Điện di các RNA tổng số tách từ mẫu mô lách người Việt Nam ................................47

Hình 6. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 .....................................................................................48

Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I....................................48

Hình 8. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI......49

Hình 9. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được.......................50

Protein_IL-2) và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen............................50

quốc tế với số đăng ký NP_000577...........................................................................................50

Hình 10. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................52

Hình 11. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I .............53

Hình 12. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2.................................54

Hình 13. Cấu trúc của hai plasmid pTZ600 và pTZ900 ...........................................................56

Hình 14. Sơ đồ mô tả quá trình tạo đột biến điểm định hướng tạo gen Trx-rhIL2-MN...........57

Hình 15. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái)..............58

Hình 16. Điện di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN trên gel polyacrylamide 12,5% .............60

Hình 17. Western blot với kháng thể kháng hIL-2 ...................................................................61

Hình 18. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12,5%...........61

Hình 19. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được

nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. .......................................................................62

Hình 20. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích

2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. ..........................................63

Hình 21. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein.......................................63

có kích thước 32 kDa.................................................................................................................63

Hình 22. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL2MN. .............................................................................64

Hình 23. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................64

Hình 24. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................66

Hình 25. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris.............67

Hình 26. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................67

Hình 27. Ảnh hưởng của IPTG tới sự biểu hiện của protein rhIL2MN...................................70

Hình 28. Ảnh hưởng của nồng độ Amp tới sự biểu hiện của protein .......................................71

Hình 29. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ................................................................71

Hình 30. Khảo sát thời gian thu mẫu biểu hiện .......................................................................72

Hình 31. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2.............73

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 6

Hình 32. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2-MN trên polyacryamide gel 12,5%...............73

Hình 33. Điện di protein tinh sạch lần 1 .................................................................................755

Hình 34. Điện di protein tinh sạch lần 2 .................................................................................755

Hình 35. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase trên gel polyacrylamide 12,5% ...766

Hình 36. Mẫu Trx-rhIL2MN giữ ở dạng đông khô sau các khoảng thời gian..........................78

bảo quản khác nhau ...................................................................................................................78

Hình 37. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro ................................................................79

Hình 38. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm....................................81

Hình 39. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động..............................82

của các IL-2 khác nhau (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quốc, US: Mỹ)............................................82

Hình 40. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính lúp) .................85

Hình 41. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................86

Hình 42. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường ....................................................86

Hình 43. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................87

Hình 44. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: .................87

Hình 45. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới

tác động của AOM: ...................................................................................................................88

Hình 46. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng..................................88

thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc do bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10).........................88

Hình 47. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang

chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10) .......................................89

Hình 48. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180......................90

sau 12 ngày cấy truyền (b).........................................................................................................90

Hình 49. Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180:.............................................91

Hình 50. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp................92

Hình 51. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm .........................................92

Hình 52. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng (x1000) ......................................93

Hình 53. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2.VN ...............................93

Hình 54. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2.TQ .................94

Hình 55. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính .......................................94

hiển vi điện tử truyền qua (x10.000). ........................................................................................94

Hình 56. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000).................95

Tế bào chết theo kiểu hoại thư...................................................................................................95

Hình 57. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) ...........................95

Hình 58. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các lô chuột thí nghiệm............................96

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 7

MỤC LỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện......................................................................8

Bảng 2. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô ................................................................77

Bảng 3. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu rhIL-2MN tái tổ hợp.....................................80

Bảng 4. Đơn vị hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm...........................................................81

Bảng 5. Khả năng hoạt hoá tế bào CTLL-2 phát triển của mẫu ở nồng độ thử khác nhau.......82

Bảng 6. Đơn vị hoạt tính của các mẫu rhIL-2 thử nghiệm........................................................82

Bảng 7. Số trung bình của u ở ruột 1 chuột trong các lô thí nghiệm ........................................85

Bảng 8. Định lượng các khối u báng Sarcoma 180 khi mổ chuột thí nghiệm ..........................90

Bảng 9. Tác động của chế phẩm IL2-TQ và IL2-VN lên thời gian sống thêm.........................96

của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180.............................................................96

Bảng 10. Các dòng gen và dòng vector tạo ra của đề tài ........................................................102

Bảng 11. Sản phẩm khoa học của đề tài .................................................................................102

Bảng 12. Danh sách các học viên được đào tạo......................................................................105

Bảng 13. Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ.........................................................105

Bảng 14. Danh sách các cơ quan hợp tác quốc tế ...................................................................105

Bảng 15. Kinh phí phân bổ cho các hạng mục........................................................................106

Bảng 16. Tóm tắt các nội dung công việc thực hiện và nội dung xin điều chỉnh ...................108

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 8

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN

Số

TT

Họ và tên

Học hàm, học vị

Chức vụ, đơn vị

Trách nhiệm

trong đề tài

Chương mục

trong báo cáo

1

PGS. TS.

Trương Nam Hải

Phó Viện trưởng,

Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền,

Viện CNSH

Chủ nhiệm đề tài

Chủ đề mục

Toàn bộ nội

dung báo cáo

2

PGS. TS.

Phan Văn Chi

Phó Viện trưởng,

Trưởng phòng Hoá sinh protein,

Viện CNSH

Chủ đề mục

3 TS. Phạm Thị Bích Hợp

Phó Phòng Công nghệ lên men

Viện CNSH

Chủ đề mục

4

PGS. TS

Đỗ Khắc Hiếu

Trưởng phòng Tế bào động vật,

Viện CNSH

Chủ đề mục

5 TS. Đinh Duy Kháng

Trưởng phòng Vi sinh phân tử,

Viện CNSH

Chủ đề mục

6

PGS. TS

Trần Công Yên

Trường Đại học khoa học tự

nhiên, ĐHQGHN

Chủ đề mục

7

GS. TS.

Nguyễn Đình Bảng

Trung tâm Quốc gia Kiểm định

Vaccin và sinh phẩm y học

Chủ trì đề tài

nhánh

8 Trần Bình Duyên Công ty CP dược TW

Mediplantex

Chủ trì đề tài

nhánh

Chưa thực

hiện

9 GS. TS. Nguyễn Bá

Đức

Bệnh viện K Hà Nội

Chủ trì đề tài

nhánh

Chưa thực

hiện

Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 9

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN

VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP

1. Nội dung: Tạo dòng gen IL-2

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học

Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Phan Văn Chi, NCS Lê Thị Bích

Thảo, Th.S Đặng Thành Nam, Th.S Nguyễn Nam Long, CN. Bùi Thị Huyền.

2. Nội dung: Tạo đột biến gen IL-2

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học

Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, CN.Vũ Minh Đức,

CN. Đặng Trần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh, NCS. Phùng Thu Nguyệt.

3. Nội dung: Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học

Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, PGS. TS Phan

Văn Chi, PGS. TS Đinh Duy Kháng, CN. Vũ Minh Đức, CN. Đặng Trần Hoàng,

KS. Lê Quỳnh Giang, Th.S Nguyễn Tiến Minh, NCS. Phạm Minh Tuấn.

4. Nội dung: Nghiên cứu điều kiện lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang

gen IL-2 ở quy mô 5 và 14 lít.

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học

Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, TS. Phạm Thị

Bích Hợp, Th.S Trần Thị Hường, CN. Vũ Minh Đức, Th.S Nguyễn Văn Hiếu,

Th.S Hồ Tuyên, Th.S Lại Thanh Tùng, Th.S Phan Thị Hồng Thảo, CN. Phạm

Thanh Huyền, CN. Phạm Kim Dung, KTV. Phan Văn Chí.

5. Nội dung: Tách chiết và tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính

chất của nó.

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học

Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trương Nam Hải, CN. Vũ Minh Đức,

CN. Đặng Trần Hoàng, CN. Nguyễn Hồng Thanh.

6. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro

Cơ quan tham gia: Viện Công nghệ sinh học.

Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Đỗ Khắc Hiếu, TS. Đỗ Thị Thảo.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 10

7. Nội dung: Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật thí nghiệm

Cơ quan tham gia: Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN.

Những người tham gia thực hiện: PGS. TS Trần Công Yên, PGS. TS Nguyễn

Thị Quỳ, ThS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, CN Bùi Thị Vân Khánh, CN. Nguyễn

Thuỷ Chung, CN. Lê Thị Thanh, CN. Vũ Đình Quang, CN. Kiều Thị Thu Hà.

8. Nội dung: Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2

Cơ quan tham gia: Trung tâm Quốc gia Kiểm định vacxin và sinh phẩm y học

Những người tham gia thực hiện: GS. TS Nguyễn Đình Bảng, TS. Nguyễn Thị

Kim Hương.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 11

BÀI TÓM TẮT

Trong những năm gần đây, bệnh ung thư đang trở thành một trong những

nguyên nhân gây tử vong cao ở nước ta do sự ô nhiễm môi trường và nguồn thực phẩm

cùng nhiều nguyên nhân khác. Do vậy việc điều trị các bệnh ung thư là rất cấp thiết,

tuy nhiên giá thành các loại thuốc điều trị ung thư thường cao và phải nhập ở nước

ngoài. Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học ở Việt Nam, việc sản xuất

các protein tái tổ hợp phục vụ cho y học ngày càng được quan tâm. Xuất phát từ nhu

cầu thực tiễn cần sản xuất thuốc ở trong nước dùng cho điều trị bệnh ung thư, Đề tài

KC.04.33 đã được xây dựng để bước đầu tạo ra các sản phẩm protein tái tổ hợp

Interleukin-2 dùng trong điều trị bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa giai đoạn muộn. Đề

tài đã được các cán bộ nghiên cứu từ 3 cơ quan phối hợp để thực hiện triển khai và thu

được các kết quả chính như sau:

1. Tạo dòng gen IL-2 và tạo đột điểm của gen IL-2

Bằng các kỹ thuật di truyền chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số từ tế bào

lách của người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2. Tuy nhiên để tạo ra IL-2 giống

như dạng thương phẩm (Proleukin IL-2), chúng tôi đã tiến hành tạo các đột biến điểm

của gen IL-2 như: i) Làm mất điểm glycosyl hóa Alanine-Proline-Threonine ở đầu N

của IL-2 bằng cách biến đổi thành Alanine-Methionine-Alanine để giảm tính độc của

IL-2 đối với tế bào, ii) đột biến gốc Cys125 thành Ser125 để hạn chế khả năng tạo sai cầu

disulfide trong phân tử IL-2, iii) hồi biến Ser25 thành Leu25 để giúp cho phân tử IL-2 có

cấu trúc giống như dạng thương phẩm Proleukin IL-2.

2. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau

Các gen IL-2 cải biến và dạng tự nhiên đã được nhân lên và gắn vào các vector biểu

hiện như pET32c (+), pPIC9, pPICzα để đưa vào các hệ biểu hiện trong E. coli và P.

pastoris. Kết quả biểu hiện gen cho thấy chúng tôi đã biểu hiện thành công các protein

lai Trx-rhIL2MN với kích thước khoảng 32 kDa và protein dạng đơn rhIL-2 với kích

thước khoảng 15,4 kDa. Chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp IL-2 đạt khoảng

90 mg/l IL-2, cao hơn 2000 lần so với dự tính và chủng nấm men P. pastoris có khả

năng tổng hợp IL-2 cao gấp 100 lần so với dự tính khoảng 5 mg/ml.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 12

3. Nghiên cứu lên men các chủng vi sinh tái tổ hợp mang gen IL-2 quy mô 5 và 14 lít.

Các chủng vi sinh tái tổ hợp E. coli và P. pastoris mang gen IL-2 đã được nuôi cấy

trong các hệ thống lên men Bioflo 110 dung tích 5 và 14 lít. Kết quả lên men trong cả

hai hệ thống đều cho xấp xỉ sinh khối khoảng 70-80 g sinh khối ướt/lít và 192 mg

protein lai Trx-IL2/lít.

4. Tách chiết và tinh chế IL-2 tái tổ hợp

Protein lai Trx-rhIL2MN tạo ra trong vi khuẩn E. coli đã được tinh sạch bằng sắc

ký ái lực và phần protein lai Trx được loại bỏ bằng enzyme enterokinase. Các thành

phần không mong muốn như chí nhiệt tố (pyrogen) đã được loại ra khỏi IL-2 tái tổ hợp

bằng bộ kit chuẩn. Protein tái tổ hợp được tổng hợp có độ tinh sạch cao đạt 99% và độ

đặc hiệu 100% với kháng thể kháng IL-2 của người.

5. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro

Hoạt tính sinh học của chế phẩm IL-2 tái tổ hợp tổng hợp trong E. coli đã được xác

định bằng phép thử sinh học trên tế bào nuôi cấy in vitro CTLL-2 đạt khoảng 2,7 x 106

U/mg, tương đương với mẫu của Trung Quốc sản xuất (2,9 x 106

U/mg). Trong khi đó,

hoạt tính của rhIL-2 biểu hiện trong nấm men cao hơn đạt 4x106

U/mg. Cả hai dạng IL￾2 tái tổ hợp đều có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào CTLL-2.

6. Thử nghiệm IL-2 trên mô hình động vật gây ung thư thực nghiệm

Kết quả nghiên cứu thử nghiệm IL-2 của VN trên chuột gây ung thư thực nghiệm đường

tiêu hóa ruột cho thấy IL-2 tái tổ hợp đã làm giảm 43,5% sinh khối u báng đường ruột, đạt

hiệu lực kháng u (+) và có thể làm tăng thời gian sống của chuột lên 51,3% so với đối chứng.

Đây là những kết quả sơ bộ ban đầu về nghiên cứu tác động điều trị của IL-2 trên mô hình tế

bào động vật, tuy nhiên nó đã chứng tỏ chế phẩm IL-2 do Việt Nam sản xuất có hoạt tính

đối với u báng ở chuột gây ung thư thực nghiệm.

7. Đánh giá chất lượng của chế phẩm IL-2

Chế phẩm IL-2 tái tổ hợp đã được gửi sang Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và

Sinh phẩm y học để đánh giá theo quy trình chuẩn (SOP) của Tổ chức Y tế thế giới.

Kết quả cho thấy chế phẩm IL-2 do đề tài tạo ra được đánh giá là an toàn, đảm bảo điều

kiện vô trùng, có tính chất lý hóa phù hợp, hiệu giá tương đương với sản phẩm do

Trung Quốc sản xuất và hàm lượng chất gây sốt trong ngưỡng cho phép.

Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33

Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 13

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

AOM Azoxymethane

DNA Axit deoxyribonucleic

Amp Ampicilin

RNA Axit ribonucleic

BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate

BMGY Buffered Minimal Glycerol Media

BMMY Buffered Minimal Methanol Media

Bp Base Pair

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

Cys Cystein

CNSH Công nghệ sinh học

dNTP 2’-deoxyribonucleotide 5’-triphosphate

dO2 dissovle oxygen

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylen diamin tetra acid acetic

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EST Electrospray Ionization

FDA Food and Drug Administration

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

Fw Forward (xuôi chiều)

GFX Glass Fiber matrix

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IL Interleukin

IPTG Isopropyl β-D-thiogalactosidase

kDa Kilo Dalton

LB Luria and Bertani

LBA Luria-Bertani Ampicilin

Leu Leucine

Lys Lysine