Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng PRSV

a

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THANH NGA

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƯA HẤU

(CITRULUS LANATUS THUMB.)

CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH

VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015

b

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thanh Nga

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU

(CITRULUS LANATUS THUMB.)

CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH

VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH

Viện Công nghệ Sinh học

HÀ NỘI, 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thanh Nga

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CÂY DƢA HẤU

(CITRULUS LANATUS THUMB.)

CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH

VIRUS ĐỐM VÒNG PRSV

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH

Viện Công nghệ Sinh học

HÀ NỘI, 2015

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, GS.TS. Lê Trần Bình đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Tường

Vân, TS. Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Phạm Thị Vân cùng tập thể cán

bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện

làm việc, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong

suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng

và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi

trong quá trình học tập và bảo vệ luận án.

Tôi xin cảm ơn Trại Sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế, Viện Công nghệ Sinh học đã

hỗ trợ tôi trong việc trồng cây thu hạt giống trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, Ban Chủ

nhiệm Khoa Nông – Lâm cùng các đồng nghiệp đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi,

giúp đỡ để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án.

Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình,

bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Nga

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án

là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng

ý và cho phép của các đồng tác giả.

Hà Nội, ngày 7 tháng 01 năm 2015

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Nga

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………….. 4

1.1. Giới thiệu về cây dưa hấu và bệnh hại dưa hấu…………………………... 4

1.1.1. Cây dưa hấu…………………………………………………………….. 4

1.1.2. Các loại bệnh hại dưa hấu………………………………………..……... 10

1.1.3. Bệnh virus hại dưa hấu………………………………………….……… 11

1.2. PRSV và PRSV gây hại trên dưa hấu……………………..……………... 13

1.2.1. Phân loại ……………………………………………………………….. 13

1.2.2. Cấu trúc…………………………………………………………………. 14

1.2.3. Phạm vi kí chủ, cơ chế truyền bệnh ……………………………………. 19

1.2.4. Biện pháp phòng trừ …………………………………………………… 20

1.2.5. PRSV gây bệnh trên dưa hấu…………………………………………… 20

1.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus….. 21

1.3.1. Kỹ thuật RNAi………………………………………………………….. 21

1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus…………….. 26

1.3.3. Một số hạn chế của công nghệ RNAi và giải pháp……………………... 28

1.3.4. Một số nghiên cứu chuyển gen tạo tính kháng virus cho dưa hấu ……... 29

iv

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………. 31

2.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu…………………………………………….. 31

2.1.1. Vật liệu thực vật………………………………………………………… 31

2.1.2. Chủng vi sinh vật, vector……………………………………………….. 31

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, vật tư………………………………………………… 32

2.1.4. Hóa chất………………………………………………………………… 33

2.1.5. Địa điểm………………………………………………………………… 33

2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………. 33

2.2.1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu………………………. 34

2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào

cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ………………………………………. 39

2.2.3. Chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu…………………… 44

2.2.4. Phân tích cây chuyển gen kháng PRSV.................................................... 45

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………… 49

3.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu ………………………………… 49

3.1.1. Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi …………………………………… 49

3.1.2. Kết quả kích thích kéo dài chồi………………………………………… 54

3.1.3. Kết quả tạo rễ cho chồi ………………………………………………… 55

3.1.4. Ảnh hưởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây in vitro… 56

3.1.5. Tổng kết quy trình tái sinh …………………………………………….. 58

3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen

vào cây dưa hấu thông qua chuyển gen gus ………………………………...… 59

3.2.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây dưa hấu trên môi trường chứa chất

v

chọn lọc Km....................................................................................................... 59

3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen....... 60

3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen................... 61

3.2.4. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu ………………………………… 63

3.2.5. Kết quả phân tích các dòng cây chuyển gen gus ………………………. 65

3.2.6. Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu................................................. 67

3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dưa hấu............................................ 68

3.4. Kết quả phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của

các dòng cây chuyển gen ................................................................................... 69

3.4.1. Phân tích các dòng cây chuyển gen T0..................................................... 69

3.4.2. Phân tích các dòng cây chuyển gen T1..................................................... 79

Chƣơng 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU….……………………. 83

4.1. Khả năng nuôi cấy in vitro cây dưa hấu……………………………….….

4.2. Khả năng chuyển gen ở dưa hấu…………………………………….…….

4.3. Tạo tính kháng virus bằng chuyển gen ở dưa hấu………………………...

4.4. Triển vọng của các dòng chuyển gen trong bối cảnh GMO chung.............

83

86

90

94

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................................. 96

1. KẾT LUẬN.................................................................................................... 96

2. ĐỀ NGHỊ........................................................................................................ 97

SUMMARY....................................................................................................... 98

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit Deoxyribonucleic

ARN Axit Ribonucleic

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

IAA Indol - 3 - Axetic Axit

IBA 3 - Indol Butyric Axit

NAA α - Naptalen Axetic Axit

bp Base pair

CP Coat protein

Nib Nuclear Inclusion Body protein

HC-Pro Helper component-proteinase

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA Ethylene diamine Tetra-acetic Acid

LB Luria-Bertani

PCR

RT-PCR

Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription polymerase chain reaction

RNAi RNA interference

miRNA microRNA

siRNA small interfering RNA

mRNA messenger RNA

dsRNA double-stranded RNA

RISC RNA-induced silencing complex

Taq Thermus aquaticus

vii

PRSV Papaya ringspot virus

Km kanamycin

Cefo Cefotaxime

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

gus beta-glucuronidase

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong dưa hấu…………………………… 9

Bảng 1.2. Danh sách các vi sinh vật gây hại chủ yếu trên dưa hấu ………….. 10

Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA và BAP… 36

Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường tái sinh có bổ sung IBA, BAP,

NAA…………………………………………………………………………… 36

Bảng 2.3. Nồng độ GA3 sử dụng trên MT kéo dài chồi……………………... 37

Bảng 2.4. Nồng độ IBA sử dụng trên MT tạo rễ …………………………….. 37

Bảng 2.5. Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro ……………….. 38

Bảng 2.6. Các nồng độ Km sử dụng................................................................... 39

Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trường ........................................................ 40

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi…………………………. 50

Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, BAP, NAA đến sự phát sinh chồi…... 53

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có

kích thước < 1cm…………………………………………………….…….….. 54

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IBA và môi trường cơ bản đến khả năng tạo rễ của

chồi dưa hấu………………………………………………………………...…. 56

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích ứng cây ra môi trường.. 58

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ Km đến sự phát triển của chồi.................... 60

Bảng 3.8. Kết quả biến nạp gen gus vào dưa hấu…………………………….. 64

Bảng 3.9. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu............ 67

Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu........ 69

ix

Bảng 3.11. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu.......... 72

Bảng 3.12. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp￾Nib-HCpro thế hệ T0 và WT ............................................................................ 75

Bảng 3.13. Kết quả PCR phân tích các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1..... 80

Bảng 3.14. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dưa hấu chuyển gen RNAi/Cp￾Nib-HCpro thế hệ T1 và cây WT....................................................................... 82

x

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cấu trúc của PRSV…………………………………………………. 15

Hình 1.2. Bản đồ tổ chức genome của PRSV…………………………………. 15

Hình 1.3. Con đường tạo thành RNAi………………………………………. 25

Hình 2.1. Sơ đồ vector pCB-gusplus…………………………………………. 31

Hình 2.1. Sơ đồ vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro ……..……………. 32

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát…………………………………………. 34

Hình 3.1. Ảnh hưởng của tuổi lá mầm dưa hấu đến khả năng tái sinh chồi…... 50

Hình 3.2. Ảnh hưởng của vị trí trên lá mầm đến khả năng tái sinh chồi……… 50

Hình 3.3. Kết quả tái sinh chồi dưa hấu từ lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy……… 52

Hình 3.4. Hình ảnh chồi có hình thái bất thường so với đối chứng…………… 52

Hình 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi.. 55

Hình 3.6. Kết quả tạo rễ cho chồi dưa hấu D2………………………………… 56

Hình 3.7. Kết quả thích ứng cây in vitro……………………………………… 57

Hình 3.8. Một số hình ảnh về xây dựng quy trình tái sinh cây dưa hấu……… 59

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến biểu hiện gus............ 61

Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến biểu hiện Gus.................... 62

Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện gus……….. 62

Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn đến

biểu hiện Gus………………………………………………………………….. 63

Hình 3.13. Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dưa hấu.................................... 65

Hình 3.14. Biểu hiện bền vững của gus ở các dòng dưa hấu chuyển gen.. ... 66

xi

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen

nptII trên gel agarose 0,8%................................................................................. 67

Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen T0

với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................................ 70

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu

PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%........................................... 71

Hình 3.18. Một số hình ảnh chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro……….… 72

Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu

PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%........................................... 73

Hình 3.20. Mẫu lá bí ngô bị nhiễm PRSV…………………………………….. 74

Hình 3.21. Các mức độ biểu hiện bệnh ở lá dưa hấu chuyển gen...................... 76

Hình 3.22. Một số hình ảnh về tính kháng bệnh PRSV của các dòng dưa hấu

chuyển gen.......................................................................................................... 78

Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen D2.7

thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................ 79

Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dưa hấu chuyển gen L2.3

thế hệ T1 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri............................ 80