Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM VĂN PHÖC

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC

HIỆU KHÁNG SINH TETRACYCLINE VÀ

ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG

Ngành: Sinh học

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60. 42. 01. 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. LÊ QUANG HUẤN

Hà Nội – 2014

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI MỞ ĐẦU

Kháng sinh là loại thuốc quan trọng được coi là chiến lược cuối cùng để điều trị

nhiễm trùng của con người. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của chúng bị đe dọa do

việc sử dụng các kháng sinh rộng rãi và không phù hợp không chỉ trong y học mà

còn trong nông nghiệp. Sự hiện diện của dư lượng kháng sinh trong thực phẩm ở

trên mức cho phép là bất hợp pháp. Vì vậy, kiểm soát dư lượng trong sữa, trong

thực phẩm…đang là vấn đề được xã hội quan tâm.

Tetracyline là một nhóm thuốc kháng sinh phổ rộng. Chúng được sử dụng vừa để

điều trị bệnh cho cả người và động vật vừa được dùng để kích thích tăng trưởng ở

động vật. Do đó, các sản phẩm thực phẩm từ động vật (thịt, trứng, sữa) có nguy cơ

chứa dư lượng Tetracycline dẫn đến nguy hại cho sức khỏe người sử dụng. Mức độ

tối đa cho phép trong sữa là 100 μg/kg, trong gan là 600 μg/kg và trong thận là 1200

μg/kg (theo tiêu chuẩn Codex).

Hiện nay, việc nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh Tetracycline trong thực

phẩm nói chung và trong sữa nói riêng chủ yếu dựa trên phương pháp phân tích hóa

lý thông thường như phương pháp vi sinh vật, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu

năng cao, ELISA. Các phương pháp này hầu hết cho độ nhạy cao, kết quả khá chính

xác. Tuy nhiên, hạn chế của các phương pháp trên ở chỗ đòi hỏi nhiều hóa chất,

dung môi; cần lượng mẫu phân tích lớn; không có khả năng phân tích nhanh theo

thời gian thực; thiết bị cồng kềnh, sử dụng phức tạp, mặt khác chi phí cho mỗi lần

còn đắt đỏ so với điều kiện kinh tế nước nhà.

Công nghệ nano đã tạo ra các loại vật liệu thế hệ mới có các đặc tính siêu việt.

Các ứng dụng của công nghệ nano vào khoa học sự sống ngày càng được phát triển

rộng rãi, trong đó việc sử dụng các vật liệu nano để tạo các cảm biến sinh học

(biosensor) đang là hướng nghiên cứu được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và

trong nước quan tâm phát triển. Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc

nano trong việc tạo các cảm biến sinh học là tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Nguyên

lý cơ bản của các cảm biến sinh học là xác định các thay đổi về quang hoặc về điện

hóa do sự tương tác đặc hiệu của các phân tử. Trong đó các tương tác kháng

nguyên-kháng thể, tương tác enzyme-cơ chất, tương tác thụ thể-ligand là những

tương tác cơ bản, đóng vai trò then chốt. Mặc dù có độ nhạy và độ đặc hiệu cao,

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

nhưng khả năng ứng dụng của các cảm biến sinh học hiện nay trên thực tế còn

nhiều hạn chế do thời gian chuẩn bị mẫu, các thao tác lâu, phức tạp. Hơn nữa, vấn

đề thu nhận và tinh sạch các kháng thể, một trong các nguyên liệu then chốt để tạo

cảm biến sinh học, là rất phức tạp, tốn kém và độ bền của kháng thể rất hạn chế.

Vì vậy, việc sử dụng các phân tử thay thế kháng thể đơn dòng trong chế tạo cảm

biến sinh học nhưng vẫn bảo đảm độ nhạy và độ đặc hiệu cao là rất cần thiết, và các

aptamer được xem là phân tử thay thế kháng thể đơn dòng phù hợp nhất trong chế

tạo các biosensor.

Aptamer là các sợi đơn DNA, các phân tử RNA hoặc các đoạn peptide có cấu

trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết với các phân tử đích khác nhau, chẳng hạn như

các phân tử hữu cơ nhỏ, các protein và các tế bào ung thư. Với các đặc tính độc đáo,

aptamer trở thành một trong những nhóm chất có nhiều tiềm năng ứng dụng trong

điều trị ung thư. So với kháng thể đơn dòng thì aptamer có nhiều ưu điểm hơn: (1)

aptamer có kích thước phân tử nhỏ hơn kháng thể và không sinh đáp ứng miễn dịch

khi sử dụng in vivo, (2) aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với các

phân tử đích tương đương hoặc hơn các phân tử kháng thể, (3) việc chế tạo các

aptamer đơn giản, nhanh, hiệu quả vượt trội so việc tạo các kháng thể đơn dòng

hoặc các kháng thể tái tổ hợp, (4) aptamer có độ bền với các tác nhân hóa, lý, môi

trường cao hơn kháng thể. Vì vậy, aptamer là một trong những hướng nghiên cứu

mới của công nghệ gen nhằm sử dụng các chẩn đoán và điều trị miễn dịch.

Từ những lí do trên, tôi xin đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc

aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hƣớng ứng dụng”

Mục tiêu của đề tài:

 Xây dựng được quy trình sàng lọc được aptamer đặc hiệu kháng sinh

Tetracycline

 Chọn dòng được ít nhất một phân tử aptamer có ái lực cao với kháng

sinh Tetracycline

 Bước đầu phát hiện được kháng sinh trong sữa bằng biosensor theo

nguyên lý điện hóa

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

CHƢƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH TETRACYCLINE

1.1.1. Kháng sinh Tetracycline

Tetracycline là một kháng sinh thuộc thế hệ cũ được tìm ra từ năm 1948, nhưng

cho đến nay nó vẫn là một loại thuốc tốt. Trong quá trình sử dụng dù tỷ lệ kháng lại

khá nhiều nhưng nó vẫn là một kháng sinh công hiệu và chưa thể loại bỏ khỏi tủ

thuốc của nhân loại.

Tetracycline là một dòng kháng sinh phổ rộng, có hiệu lực với hầu như các vi

khuẩn gram âm cũng như gram dương. Nó đã từng được coi là kháng sinh ―bách

bệnh‖ dùng cho mọi loại vi khuẩn và được sử dụng khá lạm dụng. Tỷ lệ kháng

kháng sinh này khá cao nhưng không phải vì thế mà nó mất đi công hiệu vốn có của

mình. Với những tác dụng đặc hiệu thì Tetracycline vẫn được bảo toàn sau 70 – 80

năm và là kháng sinh đầu bảng của các bệnh nhiễm Chlamydiae, bệnh nhiễm

Mycoplasma, Rickettsiae như sốt kiểu thương hàn, sốt hồi quy và đặc biệt là nhiễm

phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae gây ra bệnh dịch tả điển hình trong mùa hè.

1.1.2. Phân loại

Hình 1.1. Công thức hóa học chung của nhóm Tetracycline

( Nguồn: Từ Ming Koóng, 2004)

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Kháng sinh nhóm Tetracycline bao gồm 3 loại chính là: Oxytetracycline,

Tetracycline và Chlortetracycline. Các loại Tetracycline có cấu trúc cơ bản giống

nhau, chúng chỉ khác nhau ở gốc R.

1.1.3. Cơ chế tác động

Tetracycline được vận chuyển theo phương thức tích cực qua màng bào tương

của các vi khuẩn mẫn cảm với thuốc. Các yếu tố vận chuyển tích cực này chỉ có ở

vi khuẩn mà không có ở tế bào vật chủ. Sau khi thuốc vượt qua màng bào tương sẽ

gắn vào tiểu phần 30s của Ribosom và đồng thời cũng gắn vào cả ARN thông tin, từ

đó ngăn cản sự gắn kết các axit amin vào chuỗi peptid. Qua đó, chúng ức chế quá

trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Nếu không có các protein này thì vi khuẩn

không thể phát triển, nhân rộng và tăng số lượng. Do đó, Tetracycline làm dừng lại

quá trình lây lan và những vi khuẩn còn lại sẽ bị giết bởi hệ thống miễn dịch hoặc tự

chết dần dần.

Hình 1.2. Cơ chế tác động của Tetracycline (Nguồn: Gary E. Kaiser)

Đề kháng Tetracycline là do sự thay đổi khả năng thẩm thấu của vách tế bào vi

khuẩn. Ở những vi khuẩn nhạy cảm, thuốc được tập trung vào bên trong và khó

thoát khỏi tế bào, còn ở vi khuẩn đề kháng thì thuốc không được vận chuyển chủ

động vào bên trong hoặc dễ dàng rời khỏi tế bào một cách nhanh chóng làm nồng

độ ức chế của thuốc không còn được duy trì. Cơ chế này được kiểm soát bởi

plasmid.

1.1.4. Phổ hấp thụ

Kháng sinh nhóm Tetracycline có phổ tác dụng rất rộng. Chúng tác dụng với rất

nhiều loại vi khuẩn gram dương và âm, nhiều loại Mycoplasma, Clamidia,

6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Richketsia; tác dụng với cả các Protozoa (ở nồng độ cao) như Theileria,

Anaplasma, Eperythrozoom. Tác dụng tốt với các Clostridium, Listeria,

Streptococcus, E.rhusiopathiae, Brucella, B,bronchiseptica, Klebsiella. Không tác

dụng với P.aeruginosa, P. vulgaris [6].

1.1.5. Sự hấp thu, phân bố và thải trừ

Hấp thu

Tetracycline thường được hấp thu theo đường uống, có thể tiêm tĩnh mạch, tiêm

bắp cho động vật, tiêm dưới da cho gia cầm. Nếu đưa thuốc bằng đường miệng,

kháng sinh nhóm Tetracycline có thể giữ được nồng độ tác dụng trong máu từ 2 –

4h. Oxytetracycline được thải qua phân với nồng độ 2,5 mg/g phân khi cho uống ở

người. Khả năng hấp thu của thuốc sẽ giảm đi nhiều nếu cho uống cùng với sữa, các

sản phẩm của sữa và các muối của các ion Al3+, Mn2+, Mg2+, Ca2+…

Nếu tiêm, thuốc được hấp thu gần như hoàn toàn, nhanh đạt nồng độ hữu hiệu

trong máu hơn đường uống. Đưa bằng đường tiêm, thuốc cũng được phân bố trong

dịch tổ chức đều hơn, rộng hơn so với uống. Do vậy hiệu quả điều trị cũng cao hơn.

Sau khi uống khoảng 2 – 4h, thuốc đạt nồng độ hữu hiệu trong máu và được giữ

trong khoảng 6h hay lâu hơn, đôi khi có thể kéo dài tới 24h hay 30h. Nếu cứ sau 6h

lại uống 250 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt 1 – 3 μg/ml. Còn uống liều 500 mg,

nồng độ thuốc trong máu đạt 3 – 5 μg/ml. Liều 1 g nồng độ cao hơn 5 μg/ml. Nồng

độ này duy trì trong suốt thời gian điều trị.

Khi tiềm liều 250 – 500 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt từ 5 – 10 μg/ml [6].

Phân bố

Hàm lượng thuốc trong các tổ chức có liên quan rất lớn đến liều lượng sử dụng

với hàm lượng nước của các mô tổ chức trong cơ thể. Chúng phụ thuộc vào sự liên

kết và biến đổi của protein huyết tương. Ví dụ như Chlortetracycline 50 – 70%,

Oxytetracycline 20 – 25%.

Tất cả các dạng thuốc nhóm Tetracycline sau khi hấp thu được chuyển tới gan

theo mật đổ xuống ruột non. Hàm lượng thuốc trong gan, mật bao giờ cũng cao hơn

trong máu ít nhất từ 5 – 10 lần. Thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột – máu nên

được tồn tại lâu trong máu, vì vậy thời gian tác dụng của thuốc dài.

Thải trừ

7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Tetracycline phần lớn thải trừ qua nước tiểu. Sự lọc thải của thuốc phụ thuộc vào

công năng của thận. Nếu tiêm khoảng 20 – 60%, lượng thuốc được thải qua thận

sau 24h đầu. Có khoảng 20 – 55% liều uống cũng được thải qua nước tiểu. Trong

đó có khoảng 10 – 35% lượng Oxytetracycline thuốc thải qua nước tiểu dưới dạng

còn hoạt tính sau khi dùng thuốc 1/2h đến 5h. Còn Chlortetracycline nếu uống, chỉ

có khoảng 10 – 15% lượng thuốc được tìm thấy trong nước tiểu. Sự thải của

Chlortetracycline qua thận chỉ khoảng 35%, thấp hơn Oxytetracycline. Nếu tiêm

tĩnh mạch, 60% lượng thuốc được thải qua nước tiểu trong 12h đầu.

Nếu đưa thuốc qua đường uống, phần Tetracycline không được hấp thu sẽ thải

trừ qua đường tiêu hóa (theo phân) dưới dạng còn hoạt lực. Có khoảng 500 – 600

μg Tetracycline trong 1 g phân. Đồng thời một phần lượng thuốc tiêm cũng được

thải trừ qua phân do đó thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột rồi theo phân ra

ngoài [1].

1.1.6. Tính kháng thuốc

Kháng thuốc diễn ra chậm, theo từng bước tăng dần. Nguyên nhân do sự chuyển

vận thuốc qua màng bị rối loạn, giảm dần. Trong trường hợp kháng do R.Plasmid

thì ngược lại, lan truyền rất nhanh. Sử dụng Tetracycline quá rộng rãi, không kiểm

soát được đã tạo điều kiện làm tăng tình trạng kháng thuốc trong thực tế lâm sàng.

Tình trạng kháng thuốc ở các vi khuẩn E.coli, Salmonella, Proteus hầu như

giống nhau; tỷ lệ chủng Staphylococcus kháng thuốc thay đổi tùy tình hình, tùy địa

phương. Các chủng M.hyoneumoniae, M.bovis, Pasteurella, A.pleuropneumoniae

có tỷ lệ kháng ít nhất [6].

1.1.7. Tác dụng phụ

Không thể phủ nhận hiệu lực của Tetracycline trong việc điều trị nhiễm trùng,

đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng thuộc những vi khuẩn kể trên. Người bệnh sẽ thấy

có sự biến chuyển ngay từ liều đầu tiên cho tới khi khỏi bệnh. Song nó cũng ẩn

chứa nhiều nguy cơ có hại về mặt sức khỏe.

Khi Tetracycline được sử dụng trong chăn nuôi quá nhiều sẽ dẫn đến dư thừa

trong sản phẩm thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng. Hàm lượng dư thừa đó

được người sử dụng hấp thụ trong một thời gian dài gây tích lũy và ảnh hưởng có

hại tới sức khỏe.

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Mặc dù tương đối an toàn, các tác dụng phụ thường gặp nhất ở Tetracycline bao

gồm các phản ứng dị ứng từ nhẹ đến trung bình, nhạy cảm với ánh nắng mặt trời,

rối loạn dạ dày, hiếm khi nhức đầu nặng và các vấn đề liên quan đến thị lực.

Ngoài ra, nhóm kháng sinh Tetracycline có xu hướng tác dụng trên răng và

xương trẻ em. Do đặc tính đặc thù là kết hợp và tạo phức hợp bền (chelat) với canxi,

thành phần nhiều trong xương và răng nên Tetracycline dễ dàng tạo phức hợp bền

với yếu tố này tại hai cơ quan đang cốt hóa. Sự lắng đọng lâu và kéo dài

Tetracycline sẽ gây ra hiện tượng hỏng men răng, xỉn răng, hủy hoại sự phát triển

xương. Nếu phụ nữ mang thai vào giai đoạn cuối của thai kỳ sử dụng sữa có chứa

dư lương Tetracycline thì sẽ ngăn chặn sự phát triển xương của trẻ em. Do vậy,

kháng sinh Tetracycline tuyệt đối không được sử dụng ở bà mẹ mang thai thời kỳ

cuối (ba tháng cuối) và không dùng cho trẻ em đến khi nào đứa trẻ được 12 tuổi.

Do thuốc gây ức chế tổng hợp protein nên nó sẽ gây ra ứ đọng các axit amin, các

đơn vị tiền thân của protein. Sự dư thừa các axit amin gây tăng phân giải tạo ra các

sản phẩm ure và nitơ. Do đó mà thuốc làm tăng nồng độ ure huyết. Bởi vậy, nếu

người già và người bị các bệnh lý về thận mà vô tình bị tích lũy dư lượng

Tetracycline thì hậu quả rất nguy hiểm. Chúng sẽ làm cho sự gia tăng ure huyết là

đỉnh điểm và gây ra tai biến, có thể dẫn đến hôn mê.

Nếu xét về độc tính trên gan thì Tetracycline là một thuốc kháng sinh gây viêm

gan điển hình trong họ hàng nhà kháng sinh. Thuốc gây ra viêm gan và viêm tụy

mức độ nặng nếu chúng ta dùng liều cao và kéo dài. Do đó, trên những đối tượng

sẵn có các bệnh lý về gan và tụy như viêm gan virut, viêm tụy, viêm gan tắc mật,

viêm gan vàng da thì việc sử dụng các sản phẩm sữa chứa dư lượng kháng sinh là

một yếu tố làm tăng tình trạng bệnh..

Bên cạnh đó, việc tích lũy hàm lượng Tetracycline trong một thời gian dài còn

dẫn đến nguy cơ phá vỡ hệ cân bằng các vi sinh vật đường ruột, tạo ra các chủng

kháng thuốc kháng sinh.

1.1.8. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới

Nhu cầu về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi động vật nói chung và nuôi bò

sữa nói riêng là rất lớn. Kháng sinh được sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng