Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lema Sp/Wolffia Sp)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHỊ ĐỊNH THƯ

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP

BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRÊN TẾ BÀO

CÂY THÔNG (Larich desidue) VÀ BÈO TẤM (Lemna

sp wolffia sp)

Chủ nhiệm đề tài: LÊ HUY HÀM

7379

26/5/2009

HÀ NỘI – 2008

MỤC LỤC

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI..........................................................................1

BÀI TÓM TẮT.......................................................................................................................................2

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................................................4

LỜI MỞ ĐẦU..........................................................................................................................................5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC....................7

1.1. Tổng quan về bèo tấm.........................................................................................................7

1.1.1. Cây phân loại bèo tấm............................................................................................................7

1.1.2. Phân bố của bèo tấm..............................................................................................................7

1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm ..............................................................................8

1.1.4. Đặc điểm sinh học ..................................................................................................................8

1.2. Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm...........................................................12

1.3. Nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Woffia sp, Lemna sp..............................................13

1.3.1. Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật .....................................................................................13

1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .............................................................................15

1.3.3. Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens............................................................19

1.3.4. Hệ thống chuyển gen ở bèo tấm ..........................................................................................23

1.4. Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia / Lemna........................................................25

1.4.1. Bệnh Gumboro ở gia cầm.....................................................................................................25

1.4.2. Chiến lược nghiên cứu và thử nghiệm ứng dụng vaccine thế hệ mới...................................26

1.4.3. Gen kháng nguyên VP2 trong chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới .............................27

1.5. Nghiên cứu sản xuất vaccin qua đường miệng .................................................................29

1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước......................................................................................30

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................32

2.1. Mục tiêu của đề tài............................................................................................................32

2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện ..................................................................................32

2.3. Vật liệu..............................................................................................................................33

2.3.1. Vật liệu thực vật ...................................................................................................................33

2.3.2. Vật liệu vi khuẩn...................................................................................................................33

2.3.3. Hoá chất ...............................................................................................................................35

2. 4. Phương pháp ....................................................................................................................35

2.4.1. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện ở thực vật...............................................................35

2.4.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào........................................................................................44

2.4.3. Phương pháp biến nạp gen.................................................................................................45

2.4.4. Phương pháp đánh giá cây chuyển gen..............................................................................49

2.4.5. Thử nghiệm khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà......................................................57

CHƯƠNG3:NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐÃ THỰC HIỆN................................................58

1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN Ở THỰC VẬT....................................................................58

1.1. Kết quả khuyếch đại gen mã hoá protein của virus VP2 bằng phương pháp PCR.................58

1.2. Kết quả tạo dòng gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro .............................................58

1.2.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ pCRđ

2.1.........................................................58

1.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng InVαF’

............................59

1.2.3. Kết quả tách chiết ADN plasmid ......................................................................................60

1.2.4. Kiểm tra vectơ tái tổ hợp bằng cách cắt với enzyme giới hạn EcoRI...............................60

1.3. Kết quả giải trình tự gen mã hoá protein VP2 của virus Gumboro..........................61

1.4. Thiết kế vectơ biểu hiện VP2 .................................................................................................63

2. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ NHÂN SINH KHỐI Ở......... ......................................66

BÈO TẤM WOLFFIA, LEMMA ......................................................................................................... 66

2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm Wolffia australiana................. 66

2.1.1. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W. australiana trong các điều

kiện nuôi khác nhau .................................................................................................................67

2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của W. australiana..........................68

2.1.3. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu trong ống nghiệm W. australiana trong điều kiện nuôi

tủ ổn nhiệt ................................................................................................................................69

2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh ở bèo tấm Lemna.........................................................................70

2.2.1. Tạo vật liệu vô trùng ...................................................................................................70

2.2.2. Nghiên cứu xác định môi trường nhân cây bèo phù hợp ...........................................70

2.2.3. Tạo và nhân callus .....................................................................................................75

2.2.4. Nhân sinh khối callus dạng I......................................................................................81

2.2.5. Tái sinh cây từ callus .................................................................................................82

3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN ĐẠT HIỆU QUẢ CAO VÀO BÈO TẤM

WOFFIA SP, LEMMA SP. ..............................................................................................................86

3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Woffia sp ..............................86

3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W. australiana...................86

3.1.2. Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không...................................87

3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy......................................88

3.1.4. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy..................................................................89

3.1.5. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của kháng sinh Geneticin và Paromycine đến khả năng

gây chết bèo tấm Woffia australiana .......................................................................................90

3.2. Xây dựng qui trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm Lemna....................................92

3.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng vi khuẩn

Agrobacterium tumerfaciens....................................................................................................92

3.2.2. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây và callus sử dụng súng bắn gen ............99

4. CHUYỂN GEN VỎ VIRUS GUMBORO VÀO WOLFFIA/LEMNA.............................104

4.1. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Wolffia australiana .......................................................104

4.2. Chuyển gen vỏ virus Gumboro vào Lemna...........................................................................106

4.2.1. Chuyển gen nguyên cây bèo LA ................................................................................106

4.2.2. Tạo callus và vật liệu chuyển gen ..............................................................................107

4.2.3 Chuyển gen VP2 vào callus dạng I và dạng II...........................................................108

5. PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN .............................................................109

THỬ NGHIỆM SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRÊN GIA CẦM.............................................109

5.1. Phân tích đánh giá cây chuyển gen ....................................................................................109

5.1.1. Đánh giá biểu hiện gen gus trong các dòng bèo tấm chuyển gen.............................110

5.1.2. Tách chiết và kiểm tra ADN tổng số của bèo tấm.....................................................111

5.1.3. Phân tích PCR các dòng bèo tấm chuyển gen VP2...................................................111

5.1.4. Phân tích lai Southern...............................................................................................113

5.1.5. Xác định protein trong bèo tấm chuyển gen .............................................................113

5.2. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm .................................................................116

5.2.1. Thu mẫu huyết thanh gà............................................................................................116

5.2.2. Phát hiện kháng thể kháng protein VP2 bằng ELISA ...............................................117

CHƯƠNG 4: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC..................................121

4.1. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra......................................................................................121

4.2. Kết quả về khoa học.....................................................................................................121

4.3. Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng.............................................................................122

4.4. Trình độ công nghệ........................................................................................................122

4.5. Khả năng áp dụng.........................................................................................................123

4.6. Nhu cầu kinh tế, xã hội và địa chỉ áp dụng...................................................................123

4.7. Đào tạo.........................................................................................................................123

4.8. Sản phẩm khoa học của đề tài......................................................................................124

4.9. Hợp tác quốc tế............................................................................................................124

4.10. Tình hình sử dụng kinh phí..........................................................................................124

4.11. Danh sách các công trình công bố...............................................................................125

4.12. Hạn chế của đề tài........................................................................................................125

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................126

5.1. Kết luận.........................................................................................................................126

5.2. Đề nghị...... ...................................................................................................................126

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................................128

B¸o c¸o Tæng kÕt Khoa häc & Kü thuËt §Ò tµi

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Vòng sinh sản vô tính của L. aequinoctialis (Landolt, 1986) 9

Hình 1.2. Hoa của L.A 10

Hình 1.3. Bèo tấm W. australiana nuôi trên đĩa thạch 12

Hình 1.4. Cấu trúc pPAMksGFP 15

Hình 1.5. Cấu trúc Ti plasmid dạng octopine 19

Hình 1.6. Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật 21

Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc hệ vector nhị thể 22

Hình 1.8. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 22

Hình 2.1. Bèo tấm W. australiana No. 7540 33

Hình 2.2. Bèo tấm Lemna aequinoctialis 33

Hình 2.3: Cấu trúc của vector nhị phân pBIN GUS-int 34

Hình 2.4: Vector nhị phân pCAMBIA1301 34

Hình 2.5: Cấu trúc Vector pPAM-VP2 34

Hình 3.1. Kết quả sản phẩm PCR 58

Hình 3.2. Kết quả biến nạp gen mã hoá protein VP2 vào InVα F’ 59

Hình 3.3. Kết quả tách chiết ADN plasmid 60

Hình 3.4. Kết quả kiểm tra các dòng ADN plasmid sau khi xử lí bằng EcoRI 61

Hình 3. 5. Trình tự nucleotit của đoạn ADN tách dòng mang gen VP2 63

Hình 3.6. Phân cắt gen VP2 và vectơ pPAMksGFP với enzym cắt giới hạn. 64

Hình 3.7. Thiết kế plasmid pPAM- VP2 65

Hình 3.8. Xác định sự có mặt của gen VP2 trong chủng Agrocaterium GV3101pMp90 65

Hình 3.9. Một số hình ảnh bèo tấm LA tái sinh sau khử trùng 70

Hình 3.10. Bèo nhân trên môi trường H/5 + 1,5% sucrose, pH=6,0 74

Hình 3.11. Callus tạo được trên nền N6/2 với kết hợp 2,4D +BAP 75

Hình 3.12. Mô callus dạng II 76

Hình 3.13. Tạo callus dạng I từ callus dạng II 81

Hình 3.14. Nhân callus dạng I trên môi trường có 2,0 mg/l 2,4D + 6,0 mg/l BAP 82

Hình 3.15. Tái sinh cây từ callus dạng II 82

Hình 3.16. Bèo tái sinh từ callus dạng I trên môi trường không có chất ĐHST 83

Hình 3.17. Tái sinh bèo từ callus dạng I 85

Hình 3.18. Kết quả thí nghiệm thử chủng VK ở W. australiana 87

Hình 3.19. Xác định thời gian ly tâm chân không thích hợp 87

Hình 3.20: Ảnh hưởng của mật độ VK và thời gian đồng nuôi cấy 88

Hình 3.21: Kết quả thi nghiệm thời gian đồng nuôi cấy và mật độ VK lần 2 89

Hình 3.22: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy 90

Hình 3.23: Ảnh hưởng của geneticin đến khả năng sống của W. australiana 91

Hình 3.24: Ảnh hưởng của Paramomycin đến khả năng sống của W. australiana 92

Hình 3.25. Biểu hiện tạm tới của gen GUS trên bèo tấm với các chủng khác nhau 93

Hình 3.26. Ảnh hưởng của kanamycin tới bèo LA 97

Hình 3.27. ảnh hưởng của hygromycin tới bèo LA 98

Hình 3.28. ảnh hưởng của hygromycin tới bèo LA 99

Hình 3.29. Sàng lọc cây bèo tấm chuyển gen trên môi trường chọn lọc 106

Hình 3.30: Cánh bèo trên môi trường diệt khuẩn 107

Hình 3.31: Kết quả chọn lọc nguyên cánh LA trên môi trường bổ sung hygromycin, geneticin 107

Hình 3.32. Callus dạng I (A); callus dạng II (B) 108

Hình 3.33: Mẫu callus dạng I LA trên môi trường diệt khuẩn 108

Hình 3.34 : Callus dạng II đang tái sinh 109

Hình 3.35: Cánh bèo chuyển gen callus dạng II ở loạt thí nghiệm số 12 109

Hình 3.36: Cánh bèo chuyển gen callus dạng II ở loạt thí nghiệm số 25 109

Hình 3.37: Biểu hiện gen gus ở cánh bèo tấm W. australiana (1); W. globosa (2) và bèo LA (3)

chuyển gen sau chọn lọc

110

Hinh 3.38. Kết quả phân tích PCR gen gus các dòng bèo tấm chuyển gen 111

Hình 3.39. Kết quả phân tích PCR các dòng Lemna aequinoctialis chuyển gen 112

Hình 3.40 Kết quả phân tích PCR các dòng Wolffia australiana chuyển gen 112

Hình 3.41. Kết quả lai DNA của các dòng bèo tấm chuyển gen VP2 113

Hình 3.42. Kết quả phân tích ELISA 6 dòng bèo tấm chuyển gen VP2 116

Hình 3.43: Mô tả thí nghiệm thử khả năng gây đáp ứng miễn dịch của bèo tấm chuyển gen trên gà 120

B¸o c¸o Tæng kÕt Khoa häc & Kü thuËt §Ò tµi

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1.Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 8

Bảng 2.1. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu 51

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng khác nhau đến khả năng sinh trưởng của W. australiana 66

Bảng 3.2: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của W. australiana trong các điều kiện nuôi

khác nhau

67

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của W. australiana 68

Bảng 3.4: Tạo nguồn vật liệu khởi đầu in vitro 69

Bảng 3.5. Hiệu quả khử trùng của các loại hoá chất khác nhau 70

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng Hutner tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy 71

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy 72

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày nuôi cấy 73

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các nền khoáng và chất điều hoà sinh trưởng khác nhau đến sự tạo callus 75

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng trong môi trường N6 đến hiệu quả tạo callus 76

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của 2,4D và BAP đến hiệu quả tạo callus (%) 77

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của hàm lượng đường (g/l) đến tỷ lệ tạo callus 78

Bảng 3.13. ảnh hưởng của hàm lượng CH đến sự hình thành callus 79

Bảng 3.14. Kết quả tạo callus trên các môi trường có pH khác nhau 79

Bảng 3.15. Kết quả tạo callus dạng I từ dạng II 80

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến chất lượng callus 81

Bảng 3.17. Kết quả tái sinh callus dạng II 82

Bảng 3.18. Hiệu quả tái sinh ở các công thức có hàm lượng BAP khác nhau 83

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của IAA và kinetin tới khả năng tái sinh cánh bèo 84

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của CH tới khả năng tái sinh cây bèo từ callus 85

Bảng 3.21: Kết quả khảo sát chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào W. australiana 86

Bảng 3.22: Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian ly tâm hút chân không 87

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 88

Bảng 3.24. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời gian đồng nuôi cấy 89

Bảng 3.25. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy 89

Bảng 3.26: Kết quả thí nghiệm với geneticin 91

Bảng 3.27: Kết quả thí nghiệm với paromomycin 91

Bảng 3.28. Biểu hiện tạm thời của gen GUS trên mẫu bèo với các chủng vi khuẩn khác nhau 93

Bảng 3.29. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của các biện pháp tăng cường tiếp xúc (%) 94

Bảng 3.30. Ảnh hưởng của thời gian hút chân không tới biểu hiện tạm thời 94

Bảng 3.31. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới biểu hiện tạm thời 95

Bảng 3.32. Ảnh hưởng của AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen GUS trên mẫu bèo 96

Bảng 3.33. Ảnh hưởng của kanamycin tới hệ số nhân và sức sống bèo tấm LA 96

Bảng 3.34. Ảnh hưởng của hygromycin tới hệ số nhân và sức sống bèo tấm LA 97

Bảng 3.35. Ảnh hưởng của geneticin tới hệ số nhân và sức sống bèo tấm LA 99

Bảng 3.36. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây. 100

Bảng 3.37. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bèo tấm. 100

Bảng 3.38. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở

bèo nguyên cây

101

Bảng 3.39. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở

callus.

101

Bảng 3.40. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở bèo nguyên cây 102

Bảng 3.41. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở callus 102

Bảng 3.42. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây 103

Bảng 3.43. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus 103

Bảng 3.44. Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo tấm Wolffia australiana 105

Bảng 3.45. Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen VP2 vào bèo tấm L.aequinoctialis 106

Bảng 3.46: Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen chỉ thị vào bèo tấm LA và W. australiana 110

Bảng 3.47. Xác định protein tổng số trong dịch chiết bèo tấm chuyển gen 114

Bảng 3.48. Kết quả phân tích ELISA 6 dòng bèo tấm chuyển gen VP2 115

Bảng 3.49. Danh sách các mẫu huyết thanh gà thu được 116

Bảng 3.50: Kết quả xét nghiệm ELISA trên các mẫu huyết thanh gà đã được gây đáp ứng miễn dịch 117

Bảng 3.51: Kết quả xét nghiệm ELISA dương tính của các mẫu huyết thanh gà đã được gây đáp ứng

miễn dịch

118

Bảng 3.52: Đánh giá mức độ tạo kháng thể kháng protein VP2 trong các mẫu huyết thanh của gà ăn bèo

tấm chuyển gen

119

.

1

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI

TT Họ và tên Cơ quan công tác

A Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS. Lê Huy Hàm

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông

nghiệp

B Cán bộ tham gia nghiên cứu

1 ThS. Trần Duy Dương

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông

nghiệp

2 Th.S. Vũ Văn Tiến nt

3 TS. Phạm Thị Lý Thu nt

4 TS. Nguyễn Thị Khánh Vân nt

5 PGS. TS. Lê Thanh Hoà

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

6 PGS. TS. Đinh Duy Kháng

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

7 PGS. TS. Đỗ Năng Vịnh

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông

nghiệp

8 CN. Trịnh Thị Minh Thuỳ

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

tế bào thực vật, Viện Di truyền nông

nghiệp

2

BÀI TÓM TẮT

Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày càng

tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con người phải

ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh. Việc phòng bệnh bằng

vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng và là mục tiêu hàng đầu của ngành y tế và

thú y của các nước. Đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do giá thành vaccine

cao, ngành chăn nuôi tại các nước đang phát triển gặp nhiều rủi ro hơn nhiều so với các

nước phát triển. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành

hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới những năm gần đây.

Các nghiên cứu trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của

vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, không những

góp phần giảm giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới của việc ứng

dụng CNSH thực vật trong nông nghiệp và y học. Trong các loài thực vật được nghiên

cứu để sử dụng làm hệ thống sản xuất vaccine, các loài họ bèo tấm (Lemnaceae) đang

được đặc biệt chú ý bởi các đặc tính sau: có tốc độ nhân vô tính rất nhanh, có hàm

lượng các chất dinh dưỡng cao, rất dễ nuôi trồng, không cần các điều kiện đặc biệt như:

bảo quản lạnh, chế độ vô trùng... Do các đặc điểm trên, việc nghiên cứu sản xuất

vaccine bằng các đối tượng này là hết sức hấp dẫn và hứa hẹn nhiều triển vọng.

Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp

bằng kỹ thuật di truyền trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/

Wolffia sp.)“, được thực hiện trên cơ sở hợp tác khoa học với Viện Sinh lý phân tử và

Công nghệ sinh học, ĐHTH Bonn (CHLB Đức) là một trong những cố gắng góp phần

giải quyết các vấn đề trên để tiến tới ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền vào việc

sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chăn nuôi thú y và bảo vệ sức khoẻ

con người.

Mục tiêu của đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn đề sau: i)

Chuyển thành công gen mã hoá virus gumboro VP2 vào bèo tấm; ii) Đánh giá được

khả năng tạo miễn dịch khi cho gia cầm ăn bèo tấm có protein trên.

Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu được những kết quả

chính như sau:

• Thiết kế vector mang gen vỏ protein virus gumboro biểu hiện ở thực vật

Thu thập đánh giá các nguồn gen protein vỏ virus gumboro ở Việt Nam. Thiết kế

vector pPAM-VP2 mang gen VP2 biểu hiện ở thực vật.

3

• Xây dựng hệ thống tái sinh và nhân sinh khối ở bèo tấm (Lemna sp.; Wolffia sp.)

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã được áp dụng để xây dựng và hoàn thiện phương

pháp tạo callus và tái sinh cây ở các loài bèo tấm Wolffia sp. và Lemna sp. Một số

đặc điểm sinh học cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, tạo

callus và tái sinh cây đã được tối ưu.

• Xây dựng quy trình chuyển gen đạt hiệu quả cao vào bèo tấm (Lemna/Wolffia)

Quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây Lemna sp. và Wolfia sp. bằng súng

bắn gen và thông qua Agrobacterium đã được xây dựng và cải thiện trên cơ sở tối

ưu hoá các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình biến nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ

AS, thời gian đồng nuôi cấy...

• Chuyển gen vỏ virus gumboro vào Wolffia/ Lemna

Các thí nghiệm chuyển gen VP2 đã được thực hiện trên loài bèo tấm Wolffia

australina và Lemna aequinoctialis. Các dòng bèo tấm chuyển gen đã được duy trì

và nhân sinh khối trên môi trường có bổ sung tác nhân chọn lọc.

• Phân tích cây chuyển gen. Thử nghiệm sản phẩm chuyển gen trên gia cầm

Sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen đã được phân tích

bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southern). Đã nhận được 06 dòng

bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2. Protein VP2 đã được tách chiết từ

các dòng bèo tấm chuyển gen. Thử nghiệm bước đầu cho thấy 01 dòng bèo tấm

chuyển gen có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà.

Phía đối tác (CHLB Đức) Viện Sinh lý phân tử và công nghệ sinh học thực vật (Đại

học tổng hợp Bonn) đã thực hiện các nghiên cứu trên đối tượng cây thông (Larich

desidue) và đã thu được kết quả sau: i) Đã nghiên cứu tạo huyền phù, xác định các điều

kiện tạo huyền phù và nhân nhanh tế bào thông; ii) Tối ưu hoá quy trình chuyển gen

vào Larich desidue thông qua Agrobacterium; iii) Chuyển gen kháng virus Gumboro

VP2 vào mô sẹo và đánh giá giá biểu hiện của protein VP2 ở các dòng thông chuyển

gen.

Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu được

những kết quả rất khả quan. Các kết quả nghiên cứu đạt được mang tính khoa học và

thực tiễn cao. Thành công của đề tài là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo vaccine kháng

Gumboro giá rẻ dùng trong chăn nuôi gia cầm và xa hơn là sản xuất các hoạt chất sinh

học khác cho nông nghiệp và y học bằng kỹ thuật di truyền thực vật.

4

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid

2iP: 6-(ó,ó-Dimethylallylamino) Purin

AS: acetosyringone

BAP: 6-Benzyl Amino Purin

bp: base pair

CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter

CH: Casein Hydrolysate

cs: cộng sự

CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide

DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid

ĐC: Đối chứng

EC: Embryogenic Callus: mô sẹo phôi hoá

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

Et-Br: Ethidium Bromide

GMC: Cây trồng chuyển gen

GMO: Sinh vật chuyển gen

gus: β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase

IAA: Indol-3-Acetic Acid

IBA: Indol -3-Butyric Acid

Kbp: Kilobase

Km: Kanamycine

KTST: Kích thích sinh trưởng

LA: Lemna aequinoctialis

LB: Luria and Bertani

MCS: Multi-Cloning Site

MS: Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962)

NAA: ỏ-Naphthalenacetic Acid

NOS: Nopaline Synthetase

NOS-P: Nopaline Synthetase Promotor

nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase

OD600: Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của

hãng Beckman Coulter

PCR: Polymerase Chain Reaction

T-DNA: transferred-DNA = DNA chuyển

TDZ: Thidiazuron

Ti- Plasmid: Tumor inducing plasmid= plasmid gây khối u thực vật

X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid

5

LỜI MỞ ĐẦU

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong

lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống

cây trồng chuyển gen có các đặc tính hoàn toàn khác biệt như chống chịu sâu, bệnh,

kháng thuốc diệt cỏ... Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đã đạt 125

triệu ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn,

mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng

cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học... đã

được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (Jame, 2008).

Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây

chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa

bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng

thể, interferon, vaccine... (Mason et al, 1998).

Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau

của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men...

Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược

điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm

men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất

protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh

có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật

có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất ra

thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật"

(Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết

hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể

được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa

vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dịch

toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003). Ý tưởng sử dụng thực vật làm

hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của

nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết

quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003).

Bệnh Gumboro là bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng (Infectiuous Bursal

Disease -IBD) cấp tính do virus gây ra ở gà, chủ yếu là ở gà 2-6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết

và khả năng lây lan cao ở gà con. Tỷ lệ chết cao còn là hậu quả của suy giảm miễn dịch

do virus gây ra và sự liên - tạp nhiễm các bệnh khác. Cũng do bị suy giảm miễn dịch,

mọi chương trình vaccine phòng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị

6

ảnh hưởng, gây thiệt hại kinh tế lớn đối với gà nuôi công nghiệp (Lê Thanh Hoà, 1992;

Nguyễn Tiến Dũng, 1996; Lê Thanh Hoà, 2003).

Cấu trúc kháng nguyên của IBDV tập trung ở phần vỏ capsit. Chúng có cấu trúc

protein là VP1, VP2, VP3 và VP4. Sự khác nhau về tính kháng nguyên của các typ

virus là do cấu trúc protein của vỏ capsit quyết định. Kibenge F.S và cộng sự (1988) đã

thông báo rằng VP2 và VP3 là hai thành phần chủ yếu của virus Gumboro, chiếm 57%

và 34%. Trong khi VP1 và VP4 chỉ là protein phụ. VP1 chỉ chiếm 3% còn VP4 chỉ

chiếm 6%. VP2 là protein vỏ của virus IBD, được mã hoá bởi đoạn gen có độ dài

khoảng 1.300 nucleotide. VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’

và 3’ và thành phần amino acid, nhưng lại có một vùng khoảng gần 500 nucleotide ở

chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên được gọi là vùng “siêu

biến đổi”. Vùng này quyết định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy,

được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc

Gumboro (Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Jackwood và cs, 2008).

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền

Nông nghiệp đã được Bộ Khoa học Công nghệ cho phép thực hiện đề tài “Nghiên cứu

sản xuất protein có hoạt tính sinh học dùng trong nông nghiệp bằng kỹ thuật di truyền

trên tế bào cây thông (Larich desidue) và bèo tấm (Lemna sp/ Wolffia sp.)”. Đây là một

trong những đề tài thuộc chương trình hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và

CHLB Đức, đề tài vừa có định hướng ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ,

xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ lĩnh vực công nghệ ADN tái tổ hợp.

7

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1. Tổng quan về bèo tấm

1.1.1. Cây phân loại bèo tấm

Theo Landolt (1986), bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp

Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae, chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Wolffiella với

trên 40 loài khác nhau.

Les và cộng sự, 2002 đã dựa trên đặc điểm về hình thái, nhiễm sắc thể và vi

phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm có

5 chi tức là thêm một chi mới là Landoltia (Les và cs, 2002).

Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004 dựa trên sự so sánh

trình tự đoạn intron nằm giữa locus trnL và trnF của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ

Lemnaceae và Pistia cùng thuộc họ ráy Araceae (Rothwell và cs, 2004).

1.1.2. Phân bố của bèo tấm

Bèo tấm phân bố khắp thế giới trừ vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá

lạnh. Vùng sa mạc và vùng đất rất ẩm ướt thì khá hiếm. Trong 4 chi bèo tấm thì 3 chi

(Spirodela, Lemna, Wolffia) được phân bố khắp thế giới, Wolffiella ít có ở châu Mĩ và

châu Phi. Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở

Bắc Mĩ và Đông Nam Á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mĩ

và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mĩ, Đông Nam Á và châu Úc.

L. aequinoctialis được phân bố rộng rãi ở các vùng ấm áp trên thế giới. Cùng

với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như Nam Âu,

vùng trung tâm Bắc Mĩ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…(Landolt, 1986).

1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm

Hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao. Bèo tấm có chứa các

vitamin A, B1, B2... và các axit amin không thay thế, trừ methionin. Bèo tấm nuôi ở

điều kiện tối ưu là một trong số các loài thực vật có hàm lượng protein tổng số đạt cao

nhất. Hầu hết các loài bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8-45% phụ thuộc chủ yếu vào

điều kiện nuôi cấy (Landolt và Kandeler, 1987).

Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng,

nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi (đặc biệt là

nitơ). Hàm lượng protein và các thành phần hữu cơ khác có trong cánh bèo được liệt kê

ở bảng 2.5 (Landolt và Kandeler, 1987).

8

Bảng 1.1.Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo

Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng khô)

Proteins 6,8 – 45

Lipids 1,8 - 9,2

Sợi thô 5,7 - 16,2

Đường 14,1 - 43,6

Tro 12,0 - 27,6

Bèo sinh trưởng trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy

thì hàm lượng protein có thể đạt tới 45% trọng lượng chất khô (Leng và cs, 1994).

Hàm lượng protein này rất cao so với các loài thực vật khác và tương đương với hàm

lượng protein có trong đậu tương

1.1.4. Đặc điểm sinh học

1.1.4.1. Khái niệm cơ bản về cánh bèo

Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo), là

một tập hợp của các mô có sự biệt hoá hạn chế. Mức độ tổ chức của mô cánh bèo trong

họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986).

1.1.4.2. Hình dạng và kích thước cánh bèo

Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số loài có cánh không dẹt do có

xoang khí lớn. Cánh bèo có hình ovan (hay tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm (S.

polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối ưu.

Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm.

Kích thước và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên

ngoài và kiểu gen của chúng. Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng

đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ... (Landolt, 1986).

1.1.4.3.Hình thức sinh sản của bèo tấm

Bèo tấm có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.

Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình thức sinh sản hữu tính của

bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất thuận để bảo tồn nòi giống (Landolt,

1986; Landolt và Kandeler, 1987).

*Sinh sản vô tính