Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGÔ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐỐI

KHÁNG VỚI VI KHUẨN Xanthomonas oryzae pv.oryzae GÂY

BỆNH BẠC LÁ TRÊN CÂY LÚA

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NĂM 2017

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 60 42 01 03

Hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hòa

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

1

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp, tôi xin trân trọng cảm ơn TS.

Nguyễn Thị Hòa - Trưởng phòng Nghiên cứu Triển khai, Trung tâm Khoa học

Công nghệ và Môi trường đã trực tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cũng như giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp để có thể

thu được kết quả tốt nhất như mong muốn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm khoa học công nghệ và môi

trường, các anh, chị phòng Nghiên cứu triển khai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

học tập và nghiên cứu tại Trung tâm.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô giáo đã truyền đạt kiến thức và những

kinh nghiệm bổ ích cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Sinh Thái và Tài

Nguyên sinh vật.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè

đã luôn ở bên cạnh, luôn ủng hộ, động viên để tôi có thể hoàn thành một cách tốt

nhất khóa luận tốt nghiệp của mình.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2017

Học viên

Ngô Bích Ngọc

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

2

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU......................................................................................6

DANH MỤC HÌNH ẢNH........................................................................................9

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................11

Phần 1. MỞ ĐẦU ...................................................................................................12

1. Đặt vấn đề...................................................................................................12

2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu.............................................................13

2.1. Mục tiêu......................................................................................................13

2.2. Nội dung......................................................................................................13

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................14

1. Bệnh bạc lá lúa .................................................................................................14

1.1. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa ...................................................................16

1.2. Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa ...............................................17

1.2.1.Sử dụng thuốc hóa học ..............................................................................18

1.2.2.Chọn giống lúa kháng bệnh......................................................................18

1.2.3.Biện pháp sinh học.....................................................................................22

2. Sử dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa..23

2.1. Xạ khuẩn.....................................................................................................24

2.1.1.Giới thiệu chung về xạ khuẩn...................................................................24

2.1.2.Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn........................................26

2.2. Vi khuẩn Bacillus.......................................................................................28

2.2.1.Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus.....................................................28

2.2.2.Khả năng sinh hoạt chất của vi khuẩn ....................................................31

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................34

1. Vật liệu và hóa chất..........................................................................................34

1.1. Vật liệu........................................................................................................34

1.2. Hóa chất và dụng cụ ..................................................................................34

1.3. Môi trường nghiên cứu .............................................................................35

2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................36

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

3

2.1. Phương pháp phân lập Bacillus ...............................................................36

2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật........................................37

2.3. Phương pháp đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi

sinh vật được tuyển chọn........................................................................................

.....................................................................................................................37

2.4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn ..38

2.4.1.Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng của các chủng vi

sinh vật tuyển chọn .............................................................................................38

2.4.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

tuyển chọn............................................................................................................38

2.4.3.Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển

chọn .....................................................................................................................39

2.5. Bố trí thí nghiệm........................................................................................39

2.5.1.Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm với các chủng vi khuẩn

Xoo .....................................................................................................................39

2.5.2.Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa ...............................40

2.6. Đánh giá độc tính của chế phẩm.................................................................41

2.6.1. Phương pháp thử độc cấp ........................................................................41

2.6.2 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn............................................42

2.7. Sản xuất chế phẩm.....................................................................................43

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................44

1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas

oryzae pv. oryzae pv.oryzae ....................................................................................44

1.1. Đánh giá tính kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi

khuẩn, xạ khuẩn..................................................................................................45

1.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn ......................47

1.2.1.Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn tuyển chọn..............................47

1.2.2.Đặc điểm hình thái các chủng Bacillus tuyển chọn................................50

1.3. Đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển

chọn .....................................................................................................................51

2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn.........54

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

4

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển

chọn .....................................................................................................................54

2.1.1.Ảnh hưởng của pH ....................................................................................54

2.1.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ............................................................................57

2.1.3.Khả năng chịu mặn....................................................................................60

2.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng và sinh chất đối

kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi sinh vật

tuyển chọn............................................................................................................63

2.2.1.Nguồn Cacbon............................................................................................63

2.2.1.1.Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của các chủng vi

sinh vật tuyển chọn .............................................................................................64

2.2.1.2.Xác định nồng độ cacbon cần thiết cho các chủng vi sinh vật tuyển

chọn .....................................................................................................................67

2.2.2.Nguồn Nitơ .................................................................................................70

2.2.2.1.Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của các chủng vi sinh

vật tuyển chọn......................................................................................................70

2.2.2.2.Xác định nồng độ nitơ cần thiết cho các chủng vi sinh vật tuyển chọn

.....................................................................................................................73

2.2.3.Nguồn khoáng ............................................................................................74

2.2.3.1.Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sự sinh trưởng của các chủng vi

sinh vật tuyển chọn .............................................................................................75

2.2.3.2.Xác định nồng độ khoáng cần thiết cho các chủng vi sinh vật tuyển

chọn .....................................................................................................................78

3. Sản xuất và ứng dụng chế phẩm phòng trừ bệnh bạc lá qui mô phòng thí

nghiệm .....................................................................................................................81

3.1. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae 81

3.2. Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm ......85

3.3. Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá của chế phẩm ở qui mô

phòng thí nghiệm.................................................................................................87

3.3.1.Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm với vi khuẩn Xoo trong

môi trường lỏng...................................................................................................87

3.3.2.Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa ở quy mô phòng thí

nghiệm ..................................................................................................................88

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

5

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................91

1. Kết luận.............................................................................................................91

2. Đề nghị ..............................................................................................................91

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................93

TÀI LIỆU TIẾNG ANH ........................................................................................93

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .......................................................................................97

WEBSITE................................................................................................................98

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

6

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2. 1. Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa .......................19

Bảng 2. 2. Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa ..........................20

Bảng 4. 1. Số lượng vi sinh vật qua các mẫu đất phân lập (CFU/g)…………………… 44

Bảng 4. 2. Khả năng kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng xạ

khuẩn ..................................................................................................................................46

Bảng 4. 3 Khả năng kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi

khuẩn ..................................................................................................................................46

Bảng 4. 4. Sinh khối các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong nuôi cấy đồng sinh trưởng.53

Bảng 4. 5. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XKBL2 và chủng XKBL3

trên môi trường Gauze và ISP ............................................................................................49

Bảng 4. 6. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn tuyển chọn ........................51

Bảng 4. 7. Ảnh hưởng của pH đến các chủng vi khuẩn tuyển chọn..................................56

Bảng 4. 8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và kháng Xanthomonas

oryzae pv. oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn.......................................................57

Bảng 4. 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và sinh chất kháng của các

vi khuẩn tuyển chọn............................................................................................................59

Bảng 4. 10.Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính

kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn ..................61

Bảng 4. 11. Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính

kháng Xanthomonas oryzae pv. oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn................63

Bảng 4. 12. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn

Xanthomonas oryzae pv. oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn ...........................65

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

7

Bảng 4. 13. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv.

oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn .......................................................................67

Bảng 4. 14. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon tới các chủng xạ khuẩn tuyển chọn ............68

Bảng 4. 15. Ảnh hưởng của nồng độ cacbon tới các chủng vi khuẩn tuyển chọn.............69

Bảng 4. 16. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và hoạt tính kháng Xanthomonas

oryzae pv. oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn ....................................................71

Bảng 4. 17. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv.

oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn .......................................................................72

Bảng 4. 18. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ tới hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn..................73

Bảng 4. 19. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ tới các chủng vi khuẩn tuyển chọn..................74

Bảng 4. 20. Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sinh trưởng và hoạt tính kháng

Xanthomonas oryzae pv. oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn ...........................76

Bảng 4. 21. Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

tuyển chọn...........................................................................................................................77

Bảng 4. 22.Ảnh hưởng nồng độ khoáng tới các chủng xạ khuẩn tuyển chọn ...................79

Bảng 4. 23. Ảnh hưởng nồng độ khoáng tới các chủng vi khuẩn tuyển chọn ...................80

Bảng 4. 24. Các thông số trong quá trình sản xuất ............................................................83

Bảng 4. 25. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật của chế phẩm (Phân tích tại

Phòng thử nghiệm sinh học của Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam).........................................................................................................84

Bảng 4. 26. Số lượng chuột chết, biểu hiện bên ngoài của chuột khi uống chế phẩm ......85

Bảng 4. 27. Sự thay đổi khối lượng của chuột thí nghiệm khi cho uống chế phẩm..........86

Bảng 4. 28. Khả năng đối kháng của chế phẩm dạng lỏng với vi khuẩn Xanthomonas

oryzae pv. oryzae..............................................................................................................87

Khóa luận tốt nghiệp Ngô Bích Ngọc

8

Bảng 4. 29. Khả năng sinh trưởng và tỷ lệ mắc bệnh bạc lá ở quy mô phòng thí nghiệm

sau 4120h gieo cấy .............................................................................................................89