Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (coffea robusta) để lên men tạo ethanol :Luận án Tiến sĩ - Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI

(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ

NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

MSNCS: P1114004

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ

VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI

(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ

NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 62.54.01.01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS. TS. LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY

TS. PHẠM VĂN TẤN

2020

i

LỜI CẢM ƠN

Để có được kết quả như ngày hôm nay, ngoài sự phấn đấu và nổ lực của

chính bản thân còn có sự hỗ trợ rất lớn từ quý Thầy, Cô, gia đình, người thân

cùng bạn bè. Xin được ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý vị.

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS Lê Nguyễn Đoan Duy,

người hướng dẫn chính và TS. Phạm Văn Tấn, người hướng dẫn phụ. Hai thầy

đã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm và đặc biệt có

những ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích, thiết thực về luận án tiến sĩ của

tôi. Nó như là nguồn động lực giúp tôi luôn luôn cố gắng và phấn đấu hết mình.

Một lần nữa tôi muốn nói, tôi rất biết ơn hai thầy.

Cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS. Hồ Quảng Đồ, PGS.

TS. Nguyễn Văn Mười, PGS. TS. Lý Nguyễn Bình, PGS. TS. Nguyễn Công

Hà, PGS. TS. Trần Thanh Trúc đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi

cho tôi trong suốt tiến trình học tập.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Khoa

Sau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Bộ môn Công nghệ Thực

phẩm, Phòng thí nghiệm; các Phòng ban, Khoa liên quan đã tạo điều kiện thuận

lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường.

Đặc biệt, xin được gửi đến Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ

Sinh học và Thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh

lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất. Nhà trường và Viện đã hỗ trợ kinh phí,

điều kiện và thời gian cho tôi trong bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường

Đại học Cần Thơ. Bên cạnh đó, tôi thật sự cảm động trước tình cảm và sự quan

tâm giúp đỡ của các bạn đồng nghiệp trong và ngoài trường, xin cảm ơn các bạn

rất nhiều.

Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn

luôn ủng hộ, sát cánh bên tôi. Công ơn này tôi xin khắc sâu trong lòng.

NCS

Đỗ Viết Phương

ii

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định phương pháp tiền xử lý thích

hợp nhất trên đối tượng vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta). Đồng thời, nghiên

cứu cũng tập trung thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc phân lập

được từ quả cà phê. Sau đó là quá trình ứng dụng enzyme này vào quá trình thủy

phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả thủy phân với enzyme thương mại. Bên

cạnh đó, việc đưa ra chế độ khử độc dịch thủy phân, thiết lập các thông số cho

quá trình lên men tạo ethanol cũng được quan tâm nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu đầu tiên là quá trình khử bớt caffeine và polyphenol

trong vỏ quả cà phê bằng ba phương pháp trích ly khác nhau bao gồm: Trích ly

thông thường, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng và trích ly có sự hỗ trợ của siêu

âm. Tiếp sau đó là các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tiền

xử lý acid, kiềm, vi sóng và vi sinh vật hay sự kết hợp của các tác nhân đến mức

độ suy giảm hemicellulose và lignin. Trong nội dung thứ hai, tiến hành phân lập

nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ các nguồn: đất trồng,

quả cà phê, thân cành lá. Sau đó là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm

mốc đã phân lập được bằng các tác nhân gây kết tủa khác nhau bao gồm:

(NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone. Enzyme thu nhận được cùng với enzyme

thương mại được sử dụng để thủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả kinh

tế là những vấn đề cơ bản trong nội dung 3. Bên cạnh đó, để đảm bảo cho quá

trình lên men được thuận lợi thì dịch thủy phân cần phải được kiểm tra và loại

bỏ một số chất có độc tính đối với nấm men. Nội dung cuối cùng là khảo sát

một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men cũng như là khảo sát một

số phương pháp lên men khác nhau.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất khử caffeine và polyphenol bằng

phương pháp trích ly có sự hỗ trợ vi sóng đạt 92,3% (đối với caffeine) và 87,7%

(đối với polyphenol) cao hơn so với hai phương pháp còn lại. Tuy nhiên, vì lý

do kinh tế và tính khả thi nên phương pháp trích ly thông thường bằng nước

nóng được lựa chọn cho việc khử caffeine và polyphenol. Khi so sánh các

phương pháp tiền xử lý khác nhau cho thấy, tiền xử lý bằng phương pháp kết

hợp acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu quả cao nhất khi loại bỏ được 71,4%

hemicellulose và 79,2% lignin nhưng vẫn giữ lại được 69,5% cellulose ở điều

kiện xử lý: H2SO4 2% ở 140oC trong thời gian 45 phút, NaOH (0,2 g/g) ở 120oC

trong thời gian 20 phút và vi sóng ở mức công suất 327 W trong vòng 20 phút.

Trong số 5 dòng nấm mốc phân lập được thì chủng Trichoderma asperellum

QT5 (phân lập từ quả) có khả năng sinh tổng hợp cellulase hoạt tính cao nhất

và đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường lỏng cơ bản.

Sau đó enzyme cellulase thô được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol (tỷ lệ

iii

enzyme:ethanol là 1:3,5) thì hoạt tính CMCase tăng lên đáng kể (21,72 U/mL).

Ngoài ra, khi ứng dụng enzyme cellulase thu nhận được vào quá trình thủy phân

và lên men kết quả cho thấy, đường khử tạo ra trong dịch thủy phân bởi enzyme

cellulase thu nhận được là 26,02 g/L thấp hơn so với thủy phân bằng enzyme

thương mại Viscozyme (43,26 g/L) nhưng hàm lượng ethanol tạo thành chỉ thấp

hơn 13,8%. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp lên men SHF

cho hiệu quả thủy phân cao hơn SSF và SHF+SSF nếu không xem xét đến mặt

thời gian nhưng ngược lại phương pháp lên men SSF cho hiệu quả thủy phân

cao hơn nếu xét trong cùng một khoảng thời gian như nhau.

Từ khóa: Ethanol, sinh khối lignocellulose, Trichoderma asperellum, thu

nhận cellulase, tiền xử lý, thủy phân cellulose, vỏ quả cà phê.

iv

ABSTRACT

The aim of the study was to determine the most suitable pretreatment

method for coffee pulp (Coffea robusta). In addition, the study also focused on

recovery of mold cellulase enzyme from coffee berries. After that, this enzyme

was used in hydrolysis of the coffee pulp. Hydrolysis efficiency of the enzyme

was compared with that of commercial enzymes. Besides, the condition of

hydrolysate detoxification and parameters of the ethanol fermentation process

were also studied.

The first research content was to eliminate caffeine and polyphenols from

coffee pulp using three different extraction methods including maceration,

microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction. Then,

experiments were to investigate the effects of pretreatment agents such as acid,

alkali, microwave and microbiological or a combination of the agents on

removing of hemicellulose and lignin. In the second research, the isolation of

mold which has high biosynthesis capacity to cellulase collected from various

sources such as soil, branches, trunks, coffee pods. The third research was the

recovering process of cellulase enzyme from the mold isolated using various

precipitating agents: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol and acetone. The cellulase

enzyme (crude) and commercial enzyme were used to hydrolyze the coffee

pulp. Then, the economic efficiency in coffee pulp hydrolysis were compared

between the two enzymes. Besides, to ensure that the fermentation was perfect,

the hydrolyzate needs to be tested to remove some substances that were toxic to

yeast. The final content was to study some main factors affecting the

fermentation process as well as to investigate some different fermentation

methods.

The result showed that the eliminating efficiency of caffeine and

polyphenols using the microwave-assisted extraction method reached 92.3%

and 87.7% for caffeine and polyphenols, respectively. These were higher than

those of the other methods. However, due to economic aspects and feasibility,

the maceration was also selected for decaffeine and depolyphenols process.

When comparing different pretreatment methods, it revealed that the

pretreatment in combination of dilute acid, dilute alkali and microwave was the

most effective method, By the combination method, 69.5% of cellulose was

retained; while 71.4% of hemicellulose and 79.2% of lignin were removed

under treatment conditions as follows: H2SO4 2% at 140oC for 45 minutes, alkali

pretreated with NaOH 0.2 g/g biomass at 120oC for 20 minutes, and microwave

at 327 W for 20 minutes. Among five strains of molds isolated, Trichoderma

asperellum QT5 had the highest activity of cellulase biosynthesis and reached