nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy

i

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC ............................................................3

1.1.1. Mực ống (squid)....................................................................................3

1.1.2. Mực nang (cutlefish) .............................................................................4

1.1.3. Mực tuộc (octopus)...............................................................................5

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME ......................................................................6

1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN.......................11

1.3.1. Quá trình thủy phân.............................................................................11

1.3.2. Các phương pháp thủy phân protein....................................................13

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme ..15

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN TRÊN THẾ

GIỚI VÀ ỨNG DỤNG.....................................................................................18

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........24

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ...............................................................................24

2.1.1. Phế liệu mực .......................................................................................24

2.1.2. Ezyme Protease ...................................................................................25

2.1.3. Cá kèo :...............................................................................................25

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................26

2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu ...................................................26

2.2.2. Phương pháp phân tích hóa học:..........................................................26

2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu...............................................................29

2.2.4. Một số thiết bị sử dụng trong đề tài.....................................................39

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu...................................................................40

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...............................41

3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU MỰC TUỘC ......................41

ii

3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY

PHÂN PROTEIN CỦA PHẾ LIỆU MỰC........................................................41

3.2.1. Xác định loại enzyme protease ............................................................41

3.2.2. Xác định tỷ lệ enzyme Alcalase ..........................................................45

3.2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân ........................................49

3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân ................................53

3.2.5. Xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân ..................56

3.2.6. Xác định tỷ lệ ẩm cho quá trình thủy phân ..........................................58

3.2.7. Xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung làm chất phòng thối cho

quá trình thủy phân .......................................................................................62

3.3. THỬ NGHIỆM DÙNG DỊCH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU MỰC LÀM

THỨC ĂN BỔ SUNG CHO CÁ.......................................................................67

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ...................................................................71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................72

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

TÊN BẢNG Trang

Bảng 2.1. Điều kiện làm việc của Neutrase, Alcalase và Protamex..........................25

Bảng 2.2. Giá trị các hằng số , ß, htotal, của protein từ các vật liệu khác nhau

(Adler-Nissen 1986, trích từ P.M. Nielsen và cộng sự, 2001) .........................28

Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của mực (%)......................................................41

Bảng 3.2. Thành phần hóa học của phế liệu mực (%) ............................................41

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của loại enzyme tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo

thời gian của các mẫu thủy phân . ...................................................................42

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase tới sự thay đổi trạng thái cảm

quan theo thời gian của các mẫu thủy phân . ...................................................46

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian

của các mẫu thủy phân ...................................................................................50

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời

gian của các mẫu thủy phân . ..........................................................................54

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời

gian của các mẫu thủy phân . ..........................................................................59

Bảng 3.8. Kết quả phân tích cảm quan, DH (%) và hàm lượng Naa, NNH3 của

dịch thủy phân dưới ảnh hưởng của NaCl và sorbitol bổ sung. .......................63

Bảng 3.9. Kết quả phân tích cảm quan, DH (%) và hàm lượng Naa, NNH3 của

dịch thủy phân phế liệu mực theo thời gian. ...................................................67

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN

TÊN HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang

Hình 1.1. Mực ống Trung Hoa................................................................................. 4

Hình 1.2. Mực nang vân hổ ..................................................................................... 5

Hình 1.3. Mực tuộc.................................................................................................. 5

Hình 1.4. Biểu đồ xuất khẫu mực tuộc năm 2000-2004 ........................................... 6

Hình 2.1. Mực tuộc.................................................................................................24

Hình 2.2. Phế liệu mực tuộc thu gom từ xí nghiệp chế biến ....................................24

Hình 2.3. Cá kèo.....................................................................................................25

Hình 2.4. Bể nuôi thử nghiệm cá kèo......................................................................25

Hình 2.5. Phản ứng tạo phức của thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm

amino (H2N-R)...............................................................................................27

Hình 2.6. Qui trình thủy phân phế liệu mực ............................................................29

Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại enzyme protease thích hợp cho

quá trình thủy phân.........................................................................................30

Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho

quá trình thủy phân.........................................................................................31

Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình

thủy phân........................................................................................................32

Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá

trình thủy phân ...............................................................................................33

Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá

trình thủy phân ...............................................................................................34

Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình

thủy phân........................................................................................................35

Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung

thích hợp cho quá trình thủy phân...................................................................36

v

Hình 2.14. Qui trình nuôi thử nghiệm cá kèo bằng các dịch thủy phân phế liệu

mực ................................................................................................................37

Hình 2.15. Thiết bị xác định protein theo phương pháp Kejldahn ...........................39

Hình 2.16. Máy so màu UV/VIS............................................................................39

Hình 2.17. Thiết bị điện di......................................................................................39

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến độ thủy phân

(DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân................................................43

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến hàm lượng Naa

theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................................43

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến hàm lượng

NNH3 theo thời gian của các mẫu thủy phân ....................................................44

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến độ thủy

phân (DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân .......................................47

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm

lượng Naa theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................47

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm

lượng NNH3 theo thời gian của các mẫu thủy phân ..........................................48

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến độ thủy phân (DH %) theo

thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................51

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Naa theo thời gian

của các mẫu thủy phân ...................................................................................51

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng NNH3 theo thời

gian của các mẫu thủy phân............................................................................52

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ thủy phân (DH %)

theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................................55

Hình 3.11. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Naa theo

thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................55

Hình 3.12. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng NNH3 theo

thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................56

vi

Hình 3.13. Đồ thị mặt đáp ứng DH (%) theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân ....57

Hình 3.14. Đồ thị đường mức DH (%) theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân ......57

Hình 3.15. Đồ thị mặt đáp ứng Naa theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân............58

Hình 3.16. Đồ thị đường mức Naa theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân .............58

Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến độ thủy phân (DH %)

theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................................60

Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến hàm lượng Naa theo

thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................60

Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến hàm lượng NNH3 theo

thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................61

Hình 3.20. Đồ thị mặt đáp ứng DH(%) theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy

phân ...............................................................................................................64

Hình 3.21. Đồ thị đường mức DH (%) theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy

phân ...............................................................................................................64

Hình 3.22. Đồ thị mặt đáp ứng Naa theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân .........64

Hình 3.23. Đồ thị đường mức Naa theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân...........65

Hình 3.24. Đồ thị mặt đáp ứng NNH3 theo NaCl và sorbitol tại thời điểm 6 giờ

thủy phân........................................................................................................65

Hình 3.25. Đồ thị đường mức NNH3 theo NaCl và sorbitol tại thời điểm 6 giờ

thủy phân........................................................................................................65

Hình 3.26: Dịch phế liệu mực sau 6 giờ thủy phân (mẫu 7) ....................................66

Hình 3.27: Phổ điện di của phế liệu mực theo thời gian thủy phân..........................68

Hình 3.28: Biểu đồ tổng lượng thức ăn (viên) cá kèo sử dụng ở 30 phút đầu cho

ăn của các bể trong thời gian 10 ngày thí nghiệm ...........................................69

Hình 3.29: Biểu đồ khối lượng tăng trung bình hằng ngày của cá kèo ở các bể

trong thời gian 10 ngày thí nghiệm.................................................................69

vii

DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Kí hiệu viết tắt Diễn giải

DH : Độ thủy phân

DTP : Dịch thủy phân

ĐC : Đối chứng

Naa : Nitơ acid amin

NF : Nitơ foocmol

NNH3 : Nitơ amoniac

NTS : Nitơ tổng số

pHopt : pH tối thích

pHth : pH thích hợp

topt : Nhiệt độ tối thích

tth : Nhiệt độ thích hợp

TLK : Trọng lượng chất khô

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngành chế biến thủy

sản được coi là ngành mũi nhọn và được xem là nhiệm vụ chiến lược của nước ta.

Theo Tổng cục Thống kê, năm 2009 kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt

khoảng 4,2 tỷ USD, đó là nguồn ngoại tệ đáng kể trong ngân sách nhà nước. Các

mặt hàng xuất khẩu rất đa dạng, bao gồm các mặt hàng đông lạnh, đồ hộp, các mặt

hàng chế biến khô,…Các đối tượng dùng sản xuất thường là các loài tôm, cá,

mực,… Bên cạnh các mặt hàng xuất khẩu có giá trị lớn như tôm và cá thì mực cũng

là một trong những sản phẩm có đóng góp rất lớn cho sức tăng trưởng xuất khẩu

chung của thủy sản Việt Nam trong nhiều năm qua (Vasep). Các mặt hàng chế biến

của mực phần lớn dưới dạng đông lạnh Block, IQF, semi-IQF, đông lạnh khay hoặc

đóng gói hút chân không. Hình thức các sản phẩm chế biến như phi lê, cắt miếng,

tỉa hoa, chế biến sẵn để nấu hoặc dưới dạng sản phẩm sushi, sashimi để ăn gỏi, tẩm

bột hay các sản phẩm phối chế khác. Cùng với sự gia tăng của khối lượng mực xuất

khẩu, lượng phế liệu từ mực cũng tăng lên dẫn đến sự tồn tại nhiều vấn đề như làm

tăng chi phí xử lý nước thải, làm tăng ô nhiễm môi trường.

Lượng phế liệu mực thải ra từ các qui trình sản xuất mực là rất lớn, chiếm

khoảng 40% nguyên liệu. Hàm lượng protein trong phế liệu mực chiếm từ 72-77%

trong thành phần chất khô [46]. Theo theo Takaoka, 1995 và Meyers, 1989 (trích từ

P. Z. Lian, 2005) [46] trong thành phần protein của mực có chứa betain, các acid

amin tự do và khoảng 1,5% các peppid có trọng lượng phân tử thấp là các chất gây

kích thích bắt mồi cho tôm. Theo Jobling, 1998 hàm lượng protein trong phế liệu

mực đủ cao cho quá trình thủy phân tạo ra các peptid và các acid amin, nó có chứa

hầu hết các acid amin cần thiết cho sự phát triển và tăng tỷ lệ sống của cá nuôi.

Nhưng nhìn chung hiện nay ở nước ta phế liệu mực là đối tượng chưa được tận

dụng tốt. Đó là do phế liệu mực (bao gồm da và nội tạng…) khó phơi khô và nhanh

ôi thối, dẫn đến phế liệu mực làm khô (dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn chăn

nuôi) thu được có chất lượng không cao. Vì vậy, nếu chúng ta đem thủy phân lượng

phế liệu này để thu hồi nguồn chất dinh dưỡng sau đó bổ sung vào thức ăn cho vật

2

nuôi thì sẽ nâng cao được giá trị của nguyên liệu trong qui trình sản xuất mực và

còn có tác dụng giảm tải rất lớn cho quá trình xử lý nước thải, hạn chế sự ô nhiễm

môi trường.

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng Enzyme

Protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá” là một hướng

nghiên cứu cần thiết.

Ý nghĩa khoa học: Là tìm ra chế độ thủy phân thích hợp phế liệu mực làm

nền tảng cho việc nghiên cứu ở qui mô pilot và sản xuất công nghiệp sau này.

Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần vào việc xây dựng công nghiệp tận dụng các

phế liệu mực mang lại giá trị gia tăng cho ngành thủy sản, sử dụng nguồn nguyên

liệu hiệu quả hơn, tạo ra mặt hàng mới, giảm ô nhiễm môi trường…

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC

Mực thuộc ngành động vật thân mềm (Mollusca), bao gồm các loài mực ống,

mực nang, mực tuộc là nguồn lợi hải sản xuất khẩu rất quan trọng của Việt Nam sau

tôm và cá. Nhuyễn thể chân đầu phân bố khắp các vùng biển của Việt Nam, bao

gồm vùng Vịnh Bắc bộ, vùng biển miền Trung và vùng biển Đông, Tây Nam bộ.

Trong đó, một số loài có vùng phân bố hẹp trong phạm vi một, hai vùng biển, song

cũng có những loài có mặt ở khắp các vùng biển.

Những loài phổ biến và có giá trị kinh tế cao nhất là mực nang vân hổ (Sepia

pharaonis) mực nang mắt cáo (S.lycidas), mực nang lửa (S.latimanus), mực nang

vàng (S. esculenta), mực lá (Sepioteuthis lessoniana), mực ống Đài Loan (Loligo

chinensis), mực thẻ (L. edulis), mực tuộc (Octopus dollfusi), mực tuộc Ôxen

(Octopus ocellatus), mực tuộc đốm trắng (O. vulgaris) [61].

Sản lượng nhuyễn thể chân đầu đã xuất khẩu hàng năm đạt khoảng 50.000-

60.000 tấn, trị giá khoảng 150 triệu USD. Theo Viện Nghiên cứu Hải sản, 10 tháng

đầu năm 2007, xuất khẩu mực và bạch tuộc đạt trên 67,7 nghìn tấn, trị giá 231 triệu

USD, tăng 21% về khối lượng và 31% về giá trị so với cùng kỳ năm 2006, chiếm

7,7% tổng giá trị XKTS của nước ta [60].

1.1.1. Mực ống (squid)

Theo số liệu điều tra mới nhất, ở vùng biển Việt Nam có tới 25 loài mực ống

(mực lá), thuộc bộ Teuthoidea. Đa số mực ống sống ở độ sâu <100m nước, tập

trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50m. Ngoài ra còn có một số loài

thường sống ở các vùng biển khơi với độ sâu >100m nước. Trong các tháng mùa

khô (tháng 12-tháng 3 năm sau), mực ống di chuyển đến các vùng nước nông hơn, ở

độ sâu <30m. Trong các tháng mùa mưa (tháng 6-9), mực ống di chuyển đến các

vùng nước sâu 30-50m.

4

Hình 1.1. Mực ống Trung Hoa

Theo số liệu điều tra mới nhất, ở vùng biển Việt Nam có tới 25 loài mực ống

(mực lá), thuộc bộ Teuthoidea. Đa số mực ống sống ở độ sâu <100m nước, tập

trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50m. Ngoài ra còn có một số loài

thường sống ở các vùng biển khơi với độ sâu >100m nước. Trong các tháng mùa

khô (tháng 12-tháng 3 năm sau), mực ống di chuyển đến các vùng nước nông hơn, ở

độ sâu <30m. Trong các tháng mùa mưa (tháng 6-9), mực ống di chuyển đến các

vùng nước sâu 30-50m.

Sản lượng khai thác mực ống trên toàn vùng biển Việt nam hằng năm khoảng

24.000 tấn, trong đó vùng biển miền Nam có sản lượng cao nhất là khoảng trên

16.000 tấn (chiếm 70%), vịnh Bắc Bộ chiếm sản lượng lớn thứ nhì, khoảng 5000

tấn (20%), còn biển miền Trung có sản lượng thấp nhất khoảng 2.500 tấn (10%)

[62].

1.1.2. Mực nang (cutlefish)

Đã xác định được 15 loài mực nang thuộc lớp phụ Coleoidea, bộ Sepiodea

họ Sepiidea ở vùng biển Việt Nam. Nhìn chung, các loài mực nang đều sống tập

trung chủ yếu ở các vùng nước sâu khoảng 50m-200m. Đến mùa xuân (tháng 1,2,3)

chúng thường di cư vào gần bờ để đẻ trứng. Do đó, chúng đã trở thành sản phẩm

khai thác truyên thống lâu đời của người dân Việt Nam ở ven bờ. Tuy nhiên, việc

5

mở rộng khai thác xa bờ đã và đang giúp cho nghề khai thác mực của Việt nam có

nhiều triển vọng tăng sản lượng.

Hình 1.2. Mực nang vân hổ

Mực nang là thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ chế biến và được

làm thành nhiều món ăn ngon, vừa mang tính nghệ thuật vừa có giá trị xuất khẩu

cao trên thị trường quốc tế.

Sản lượng khai thác mực nang hằng năm của Việt Nam khoảng 26.000 tấn,

phần lớn ở vùng biển Nam Bộ đạt khoảng 20.000 tấn, chiếm khoảng 76% tổng sản

lượng mực nang. Miền Trung chiếm sản lượng khoảng 5.000 tấn (21%) và miền

Bắc khoảng 1.000 tấn (3 %) [63].

1.1.3. Mực tuộc (octopus)

Hình 1.3. Mực tuộc