Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch Bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus Plantarum

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN CẤP TRƢỜNG

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ

TINH SẠCH BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN

LACTOBACILLUS PLANTARUM

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Thuộc nhóm ngành khoa học: Sinh hóa

TP.Hồ Chí Minh, Tháng 04, Năm 2013.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN CẤP TRƢỜNG

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ

TINH SẠCH BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN

LACTOBACILLUS PLANTARUM

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Thuộc nhóm ngành khoa học: Sinh hóa

Sinh viên thực hiện: Lƣơng Thị Mơ Nam, Nữ: Nữ

Dân tộc: Kinh

Lớp, khoa: Công nghệ sinh học Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

Ngành học: Công nghệ thực phẩm

Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Lệ Thủy

ThS. Nguyễn Thị Phƣơng Khanh

TP.Hồ Chí Minh, Tháng 04, Năm 2013.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................................

1.1. Tổng quan về bacteriocin. ........................................................................................ 3

1.1.1. Định nghĩa về bacteriocin.................................................................................. 3

1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 4

1.1.3. Tính chất của bacteriocin................................................................................... 8

1.1.4. Cơ chế hoạt động ............................................................................................ 11

1.1.5. Ứng dụng bacteriocin hiện nay ....................................................................... 14

1.1.6. Các nghiên cứu hiện nay ................................................................................. 16

1.2. Sơ lƣợc về Lactobacillus plantarum ...................................................................... 19

1.2.1. Đặc điểm hình thái của Lactobacillus plantarum ........................................... 19

1.2.2. Đặc điểm của Lactobacillus plantarum........................................................... 20

1.2.3. Chức năng........................................................................................................ 21

1.2.4. Cấu trúc tế bào, chuyển hóa. ........................................................................... 22

1.2.5. Ứng dụng ......................................................................................................... 23

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................

2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 25

2.1.1. Chủng giống vi sinh vật................................................................................... 25

2.1.2. Hóa chất và thiết bị.......................................................................................... 25

2.1.3. Môi trƣờng sử dụng ........................................................................................ 25

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 28

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................................. 28

2.2.2. Quy trình thu nhận và tinh sạch bacteriocin.................................................... 28

2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 30

2.3.1. Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính của bacteriocin ..... 30

2.3.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của các điều kiện đến quá trình thu nhận bacteriocin.

................................................................................................................................... 34

2.3.3. Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của quá trình sắc ký lọc gel Sephadex G-50 đến

chất lƣợng của Bacteriocin ........................................................................................ 36

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................

3.1. Kết quả quá trình sinh tổng hợp bacteriocin........................................................... 41

3.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính của bacteriocin .... 41

3.2.1. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của tác nhân tủa dung môi hữu cơ đến quá

trình thu nhận bacteriocin.......................................................................................... 41

3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 đến quá trình thu nhận

bacteriocin. ................................................................................................................ 45

3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của các điều kiện đến quá trình thu nhận

bacteriocin. .................................................................................................................... 49

3.3.1. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian tủa đến quá trình thu nhận

bacteriocin. ................................................................................................................ 49

3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến quá trình thu nhận bacteriocin..................... 54

3.4. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của quá trình sắc ký lọc gel Sephadex G-50 đến

chất lƣợng của Bacteriocin ............................................................................................ 57

3.4.1. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của tốc độ dòng chảy đến chất lƣợng của

bacteriocin thu đƣợc. ................................................................................................. 57

3.4.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của lƣợng mẫu nạp vào cột đến chất lƣợng của

bacteriocin thu đƣợc. ................................................................................................. 64

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................

4.1. Kết luận: ................................................................................................................. 65

4.2. Kiến nghị: ............................................................................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 65

PHỤ LỤC ............................................................................................................................i

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại Bacteriocin theo hƣớng của Heng và Tagg.............................. 7

Bảng 1.2: Tính chất hóa lý của một vài bacteriocins của vi khuẩn gram dƣơng. .. 10

Bảng 2.3: Tác nhân tủa và tỉ lệ tủa để thu nhận bacteriocin. ................................. 31

Bảng 2.4: Các khoảng nhiệt độ và thời gian tủa để thu nhận bacteriocin.............. 34

Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến khả năng thu nhận bacteriocin. . 42

Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của muối (NH4)2SO4 đến quá trình thu nhận bacteriocin ... 46

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của thời gian tủa đến quá trình thu nhận bacteriocin.......... 49

Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tủa đến quá trình thu nhận bacteriocin........... 50

Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt độ tủa đến quá trình thu nhận

bacteriocin .............................................................................................................. 50

Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của pH đến quá trình thu nhận bacteriocin......................... 55

Bảng 3.7: Hoạt tính riêng của bacteriocin thu đƣợc sau sắc ký với các tốc độ dòng

chảy khác nhau. ...................................................................................................... 62

Bảng 3.8: Hoạt tính riêng của bacteriocin thu đƣợc sau sắc ký với lƣợng mẫu khác

nhau ........................................................................................................................ 66

DANH MỤC HÌNH/ SƠ ĐỒ/ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Cấu trúc của Nisin .................................................................................... 5

Hình 1.2: Cấu trúc ba chiều của Leucocin ............................................................... 6

Hình 1.3 : Cấu tạo của Nisin .................................................................................... 9

Hình 1.4 : Cơ chế hoạt động của bacteriocin nhóm I và II ................................... 13

Hình 1.7: Trực khuẩn L. plantarum....................................................................... 19

Hình 1.6: Khuẩn lạc L. plantarum......................................................................... 19

Hình 1.8: Sơ đồ mạch của thế hệ năng lƣợng trao đổi chất và năng lƣợng quy định

của pH trong tế bào bằng cách decarboxylation và antiport electrogenic.............. 22

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của dịch chứa bacteriocin ................... 41

Hình 3.2: Ảnh hƣởng của tác nhân dung môi hữu cơ đến hoạt tính kháng khuẩn

của bacteriocin........................................................................................................ 45

Hình 3.3: Ảnh hƣởng của tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 đến hoạt tính kháng khuẩn

của bacteriocin........................................................................................................ 48

Hình 3.4: Ảnh hƣởng của thời gian tủa đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin.

................................................................................................................................ 54

Hình 3.5: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin. ........... 57

Hình 3.6: Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin ở các phân đoạn sau sắc ký với

tốc độ 1 giọt / phút.................................................................................................. 63

Hình 3.7: Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin ở các phân đoạn sau sắc ký với

lƣợng mẫu sử dụng 3ml.......................................................................................... 67

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ các giai đoạn nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch

bacteriocin từ Lactobacillus plantarum ................................................................. 28

Sơ đồ 2.2: Quy trình thu nhận và tinh sạch bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus

plantarum ............................................................................................................... 29

Sắc ký đồ 3.7: Sắc ký đồ của dịch bacteriocin sau tủa khi qua cột Sephadex G-50

với tốc độ chảy 12 giọt/ phút.................................................................................. 58

Sắc ký đồ 3.8: Sắc ký đồ của dịch bacteriocin sau tủa khi qua cột Sephadex G-50

với tốc độ chảy 6 giọt/ phút.................................................................................... 60

Sắc ký đồ 3.9: Sắc ký đồ của dịch bacteriocin sau tủa khi qua cột Sephadex G-50

với tốc độ chảy 1 giọt/ phút.................................................................................... 61

Sắc ký đồ 3.10: Sắc ký đồ của dịch bacteriocin sau tủa khi qua cột Sephadex G-50

với lƣợng mẫu 5ml. ................................................................................................ 64

Sắc ký đồ 3.11: Sắc ký đồ của dịch bacteriocin sau tủa khi qua cột Sephadex G-50

với lƣợng mẫu 3ml. ................................................................................................ 65

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Kí hiệu viết tắt Diễn giải

C Carbon

CFU Colony Forming Unit

ĐK Đƣờng kính

E. coli Escherichia coli

h Hour (Giờ)

LAB Lactic Acid Bacteria (vi khuẩn lactic)

L. Lactobacillus

MRS De man, Rogosa, Sharpe

OD Optical density

pH Potential Hydrogen

Pr Protein

Ctv Cộng tác viên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH SẠCH

BACTERIOCIN TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM.

- Sinh viên thực hiện:

Sinh viên Lớp Khoa Năm thứ Số năm đào tạo

Nguyễn Đức Khắng SH09TP CNSH 4 4

Lƣơng Thị Mơ SH09TP CNSH 4 4

Võ Đình Trung SH09TP CNSH 4 4

Trần Thị Toán SH10A2 CNSH 3 4

- Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. NGUYỄN THỊ LỆ THỦY

ThS. NGUYỄN THỊ PHƢƠNG KHANH

2. Mục tiêu đề tài:

Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thu nhận và tinh sạch

bacterion từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum.

3. Tính mới và sáng tạo:

Sử dụng một số sản phẩm ngoại bào do vi sinh vật sinh tổng hợp làm phụ

gia bảo quản thực phẩm. Phụ gia bảo quản có nguồn gốc sinh học, không gây

những tác dụng phụ cho ngƣời sử dụng, kéo dài thời gian bảo quản và không làm

ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm.

Sử dụng các phƣơng pháp khác nhau để thu nhận bacteriocin có chất lƣợng

tốt nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm.

4. Kết quả nghiên cứu:

- Bacteriocin thô đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp kết tủa với muối

(NH4)2SO4 bão hòa ở nồng độ 70 %.

- Điều kiện thu nhận bacteriocin tốt nhất với các thông số: thời gian kết tủa:

8 giờ, nhiệt độ: 300C trong môi trƣờng có pH = 3.

- Bacteriocin đƣợc tinh sạch với phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-50

với các thông số tối ƣu:

 Tốc độ dòng chảy: 1 giọt/phút

 Lƣợng mẫu nạp: 3 ml

 Dung dịch đệm acetat có pH = 3,8.

5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng

và khả năng áp dụng của đề tài:

Đa dạng hóa các sản phẩm phụ gia thực phẩm có nguồn gốc sinh học nhằm

nâng cao chất lƣợng sản phẩm và đảm bảo sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng

6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (nếu có)

hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Ngày 09 tháng 04 năm 2013

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Lƣơng Thị Mơ