Thư viện tri thức trực tuyến
Kho tài liệu với 50,000+ tài liệu học thuật
© 2023 Siêu thị PDF - Kho tài liệu học thuật hàng đầu Việt Nam
Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis
Nội dung xem thử
Mô tả chi tiết
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐINH THỊ THU HẰNG
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
Hà Nội - 2017
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐINH THỊ THU HẰNG
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI
Bacillus anthracis VÀ Yersinia pestis
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07
LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
Học viện Quân y
2. PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh
Viện Nghiên cứu hệ gen
Hà Nội - 2017
i
LỜI CẢM ƠN
Trên con đường khoa học đầy vinh quang nhưng cũng không ít những chông
gai và hoàn thành luận án này mới chỉ là bước khởi đầu, tôi thấy mình thật may mắn
bởi luôn có những người thầy, cộng sự, người thân đã đồng hành cùng tôi.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nguyễn
Thái Sơn và PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh, những người thầy luôn tận tụy, góp ý cho
tôi, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành
luận án.
Luận án được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh y học; Trung tâm Nghiên cứu Y
Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Phòng Công nghệ sinh học môi trường,
Viện Công nghệ sinh học, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị em đồng
nghiệp giành cho, tôi xin phép được gửi tới lòng biết ơn chân thành nhất. Luận án
nhận được sự hỗ trợ quý báu bởi đề tài cấp Bộ Quốc Phòng “Nghiên cứu chế tạo kit
PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và dịch hạch”, do
PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn làm chủ nhiệm.
Đồng thời, để có thể hoàn thành được chương trình học tập cũng như hoàn
thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và nhiệt tình của các cá
nhân và cơ quan, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:
GS. TS. Trương Nam Hải, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã
dành cho tôi những đóng góp quý báu về nội dung nghiên cứu chính giai đoạn đầu
của nghiên cứu sinh cùng những quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận án.
Ban Lãnh đạo, Bộ phận Đào tạo Viện Công nghệ sinh học; Đảng ủy, Ban
Giám đốc Học viện Quân y; Ban Cán bộ, Phòng Chính trị; Chỉ huy Trung tâm
Nghiên cứu Y Dược học Quân sự đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí và trang
thiết bị.
TS. Đoàn Trọng Tuyên, Cục Quân y đã tạo điều kiện thuận lợi về chủng
nghiên cứu cùng những chia sẻ về kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu
với các mầm bệnh nguy hiểm.
Cuối cùng là gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn tin tưởng, động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.
Đinh Thị Thu Hằng
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng
cộng tác với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
NCS. Đinh Thị Thu Hằng
iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tên đầy đủ Giải nghĩa
API Analytical profile index
BHI Brain heart infusion Môi trường dinh dưỡng BHI
BLAST Basic local alignment search tool Công cụ tìm kiếm sắp
xếp cơ bản
Bp Base pairs Cặp base
BSL-3 Bio-safety level 3 An toàn sinh học cấp 3
CDC Centers for Disease Control and
Prevention
Trung tâm kiểm soát và phòng
ngừa dịch bệnh
CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc
CRMs Certified reference materials Vật liệu tham chiếu được chứng
nhận
dNTPs Deoxynucleotide triphosphates
EQA External quality assessment Đánh giá chất lượng từ bên ngoài
IC Internal amplification control Chứng nội tại
ID Identification Định danh
IS International standard Mẫu chuẩn quốc tế
ISO International standard
organization
Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế
Kb Kilo base
LAMP Loop mediated isothermal
amplification
Khuếch đại đẳng nhiệt tạo vòm
LB Luria-Bertani
MCS Multiplex cloning site Vùng đa điểm cắt
iv
mPCR Multiplex PCR PCR đa mồi
NAT Nucleic acid amplification
testing
Xét nghiệm khuếch đại dựa trên
axit nucleic
NCBI The National Center for
Biotechnology Information
Trung tâm Quốc gia về thông tin
công nghệ sinh học
NGS Next generation sequencing Giải trình tự thế hệ mới
NIBSC The National Institute for
Biological Standards and Control
Viện Quốc gia về kiểm chuẩn
sinh học
NIST The National Institute of
Standards and Technology
Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và
Công nghệ
OD Optical density Mật độ quang học
ORF Open reading frame Khung đọc mở
PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
QA Quality assurance Đảm bảo chất lượng
QC Quality control Kiểm soát chất lượng
RMs Reference materials Các vật liệu tham chiếu
Rpm Resolution per minute Vòng/phút
SNPs Single nucleotide
polymorphisms
Đa hình nucleotide đơn
SRMs Standard Reference Materials Các vật liệu tham chiếu chuẩn
TBE Tris - Borate - EDTA
YHDPQĐ Y học dự phòng Quân đội
WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới
v
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Đặc điểm hệ gen của chủng B. anthracis Ames................................8.....
Bảng 2.1. Thông tin các chủng vi khuẩn nghiên cứu.............................................. 34
Bảng 2.2. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng và giải trình tự ................................ 36 ....
Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi tạo dòng chứng nội tại cạnh tranh ................................ 37 ....................
Bảng 2.4. Các máy và thiết bị chính ............................................................................................. 37
Bảng 2.5. Thành phần dự kiến của mPCR xác định đồng thời B. anthracis
và Y. pestis................................................................................................ 41 ....................
Bảng 3.1. Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và Y.
pestis............................................................................................................................. 52
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR ................................ 60 .............
Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR................................ 60 .................
Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR ................................ 62 ...............
Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả tối ưu dung dịch đệm trong mPCR................................ 62 ..................
Bảng 3.6 Các thành phần cho mPCR tối ưu với 6 cặp mồi xác định gen
vrrA, pagA, capA, ypo2088, pla, caf1 phát hiện đồng thời B.
anthracis và Y. pestis................................................................................................ 63 .. 6
Bảng 3.7. Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis................................ 70 ...
Bảng 3.8. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định B. anthracis ................................ 71 ..................
Bảng 3.9. Bảng pha loãng DNA xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis................................ 72 .........
Bảng 3.10. Bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu kiểm định kit B. anthracis................................ 74 .................
Bảng 3.11. Đánh giá độ nhạy của mPCR với B. anthracis trên bộ mẫu
chuẩn............................................................................................................................. 75
Bảng 3.12. Đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu
chuẩn............................................................................................................................. 76
vi
Bảng 3.13. Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit mPCR với B. anthracis................................ 77 .............
Bảng 3.14. Đánh giá độ đặc hiệu của kit mPCR với Y. pestis trên bộ mẫu
chuẩn............................................................................................................................. 78
Bảng 3.15. Tổng hợp kết quả định danh xác định các chủng B. anthracis
bằng kit API50 CH ................................................................................................ 82 .......
Bảng 3.16. Tổng hợp các đột biến được xác định trên các chủng Bacillus
anthracis................................................................................................ 92 .......................
vii
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Bacillus anthracis trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm máu ......... 4
Hình 1.2. Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu......................... 5
Hình 1.3. Yersinia pestis trên tiêu bản nhuộm Wright - Giemsa ................................ 11 ..................
Hình 1.4. Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu ............................................................ 12
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình tạo dòng chứng nội tại tái tổ hợp pJET1.2-capAIC1................................................................................................................................ 43 .
Hình 3.1. Các đoạn sản phẩm PCR tương ứng với 5 cặp mồi khác nhau gen
vrrA ............................................................................................................................... 48
Hình 3.2. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA với kích thước khác
nhau............................................................................................................................... 49
Hình 3.3. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pagA với kích thước khác
nhau............................................................................................................................... 49
Hình 3.4. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen capA với kích thước khác
nhau............................................................................................................................... 50
Hình 3.5. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen ypo2088 với kích thước
khác nhau ................................................................................................ 50......................
Hình 3.6. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen pla với kích thước khác
nhau............................................................................................................................... 51
Hình 3.7. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen caf1 với kích thước khác
nhau............................................................................................................................... 51
Hình 3.8. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của B. anthracis Ba1 bằng PCR
đơn mồi ................................................................................................5......................... 3
Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis bằng
mPCR với 3 cặp mồi vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1 ................................ 54 .........
Hình 3.10. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích của Y. pestis Yp1 bằng PCR đơn
mồi................................................................................................................................ 55 .
viii
Hình 3.11. Sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y. pestis Yp1 bằng
mPCR với 3 cặp mồi ypo2088F1/R1, plaF1/R1, cafF1/R1 ................................ 56 ..........
Hình 3.12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, từng loại DNA khuôn ................................ 56 ..................
Hình 3.13. Sản phẩm mPCR với 6 cặp mồi, 2 loại tác nhân........................................................... 57
Hình 3.14. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR ................................................................ 58 ....................
Hình 3.15. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong mPCR................................................................ 59 ...........
Hình 3.16. Tối ưu nồng độ MgCl2 trong mPCR................................................................ 61 .............
Hình 3.17. Tối ưu nồng độ dNTPs trong mPCR................................................................ 61 .............
Hình 3.18. Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI và tạo dòng
phụ trong vector pJET1.2/blunt ................................................................ 64 ....................
Hình 3.19. Các kết quả tạo dòng chứng nội tại pJET1.2-capA-IC1 ................................ 65 ...............
Hình 3.20. Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC trong quá trình tách chiết
DNA ở các nồng độ khác nhau với mẫu B. anthracis ................................ 66 ..................
Hình 3.21. Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung chứng nội tại trong quá trình
tách chiết DNA ở các nồng độ 105
và 5x104
copy................................67........................
Hình 3.22. Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng................................ 69 .........
Hình 3.23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis ................................................................ 70 ......
Hình 3.24. Xác định ngưỡng phát hiện Y. pestis................................................................ 73 .............
Hình 3.25. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis ................................ 76 .....
Hình 3.26. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với Y. pestis................................ 76 ............
Hình 3.27. Kiểm tra mPCR trên bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis và Y.
pestis.............................................................................................................................. 77
Hình 3.28. Đánh giá độ đặc hiệu với B. anthracis của bộ kit BaYp-mPCR................................ 78 ...
Hình 3.29. Kiểm định độ đặc hiệu với Y. pestis của bộ kit BaYp-mPCR ................................ 78 ......
Hình 3.30. Kiểm tra mPCR ngay sau khi tạo master mix............................................................... 79
Hình 3.31. Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản một tháng.............................. 79
ix
Hình 3.32. Kiểm tra độ ổn định của mPCR sau thời gian bảo quản 12 tháng ................................ 80
Hình 3.33. Khuẩn lạc các chủng nghi ngờ B. anthracis trên thạch máu cừu................................ 81 ..
Hình 3.34. Định danh chủng B. anthracis Ba3 bằng kit API 50 CH................................ 81 ..............
Hình 3.35. Khuẩn lạc Y. pestis trên môi trường thạch máu ............................................................ 82
Hình 3.36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật mPCR
tối ưu chứa chứng nội tại IC ................................................................8......................... 3
Hình 3.37. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của B. anthracis Ba3 ................................ 85 .
Hình 3.38. Kiểm tra sản phẩm tổng hợp các gen đích của Y. pestis ................................ 86 ..............
Hình 3.39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt........................................................... 87
Hình 3.40. So sánh trình tự nucleotide gen vrrA của 10 chủng B. anthracis
với các chủng tham chiếu trên Genbank................................................................ 89 .......
Hình 3.41. Xác định một số đột biến điểm trên trình tự nucleotide gen pagA
của 3 chủng Ba1, Ba3 và Ba4 khi so sánh với 15 chủng B.
anthracis tham chiếu................................................................................................ 90 .....
Hình 3.42. So sánh trình tự gen capA của 3 chủng B. anthracis với 12 chủng
B. anthracis tham chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có đột
biến điểm)................................................................................................ 91......................
Hình 3.43. So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi gen capA
3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham chiếu
trên Genbank ................................................................................................ 91 .................
Hình 3.44. So sánh trình tự nucleotide và axit amin (gen pla) của 2 chủng Y.
pestis Yp1, Yp2 với 4 chủng tham chiếu ................................................................ 93 ......
x
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn.................................................................................................................... i
Lời cam đoan ................................................................................................................ ii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt........................................................................... iii
Danh mục bảng............................................................................................................. vi
Danh mục hình ............................................................................................................. viii
MỞ ĐẦU...................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN B. anthracis VÀ Y. pestis................................4...
1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn B. anthracis ............................................................. 4
1.1.2. Tổng quan về vi khuẩn Y. pestis................................................................11....
1.1.3. B. anthracis, Y. pestis và vũ khí sinh học...................................................... 17
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH B. anthracis, Y. pestis................................ 18.
1.2.1. Các phương pháp vi sinh truyền thống.......................................................... 18
1.2.2. Các phương pháp xác định sinh hóa.............................................................. 20
1.2.3. Các phương pháp xác định dựa trên ái lực .................................................... 20
1.2.4. Các phương pháp xác định dựa trên axit nucleic .......................................... 22
1.3. KIỂM ĐỊNH KIT mPCR CHẨN ĐOÁN.............................................................. 30
1.3.1. Kiểm định kit PCR chẩn đoán trên thế giới................................................... 30
1.3.2. Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ở Việt
Nam............................................................................................................... 31
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................... 34
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU................................................................................... 34
2.1.1. Các chủng vi khuẩn, plasmid......................................................................... 34
xi
2.1.2. Sinh phẩm, hóa chất....................................................................................... 34
2.1.3. Các máy, thiết bị nghiên cứu ......................................................................... 37
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu...................................................................................... 37
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................... 38
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ....................................................................................... 38
2.2.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu......................................................... 38
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................................................... 48
3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH
ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis............................................................. 48
3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR ................................ 48..
3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR.............................................................. 53
3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis
và Y. pestis................................................................................................5.... 7
3.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR ............. 63
3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis................... 68
3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR
TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP.................... 69
3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu
chuẩn............................................................................................................... 69
3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng
phân lập......................................................................................................... 80
3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis ............ 94
Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................ 95
4.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B.
anthracis VÀ Y. pestis ........................................................................................ 95
4.1.1. Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis
và Y. pestis................................................................................................ 95..
xii
4.1.2. Chứng nội tại trong mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y.
pestis........................................................................................................... 100
4.2. KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ
MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ................................................ 103
4.2.1. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn ................ 103
4.2.2. Khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập .............. 107
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................... 116
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.................... 118
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH............................................................ 119
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 125
PHỤ LỤC
1
MỞ ĐẦU
Bacillus anthracis và Yersinia pestis là hai loài vi khuẩn gây bệnh tối nguy
hiểm tương ứng là bệnh than và dịch hạch, từng gây nên nỗi kinh hoàng trong lịch
sử loài người, có thể bị lợi dụng làm vũ khí sinh học. Bởi tính chất dễ lây truyền và
tỷ lệ tử vong cao qua đường hô hấp, theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch
bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention, USA - CDC), B. anthracis
và Y. pestis được phân loại là những tác nhân khủng bố sinh học nhóm A (nhóm các
tác nhân sinh học tối nguy hiểm). Ở Việt Nam, B. anthracis còn xuất hiện rải rác ở
các tỉnh miền núi phía Bắc, trong khi Y. pestis vẫn tồn tại trên một số loài gặm
nhấm ở khu vực Tây Nguyên và có thể bùng phát thành dịch bất kỳ lúc nào. Mặt
khác, chúng ta cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời trong phòng chống khủng
bố sinh học.
Trong một vụ tấn công nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu môi trường
nghi nhiễm các mầm bệnh này, việc phát hiện nhanh, chính xác tác nhân sinh học là
một trong những yếu tố quyết định đến sức khỏe cộng đồng và an ninh quốc gia.
Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm bảo
điều trị chính xác. Phương pháp nuôi cấy truyền thống được xem là “tiêu chẩn
vàng” trong xác định B. anthracis và Y. pestis. Tuy nhiên, mặc dù có độ nhạy cao,
phương pháp này đòi hỏi thời gian 2 - 3 ngày, một số trường hợp độ đặc hiệu không
cao, cần tiến hành các thử nghiệm bổ sung. Ngoài ra, phương pháp nuôi cấy cần tiến
hành ở điều kiện phòng an toàn sinh học cấp 3 (Biosafety level 3, BSL-3) với nhân
viên được đào tạo và có kinh nghiệm. Các phương pháp miễn dịch được nghiên cứu
dưới dạng các que thử nhanh rất thuận tiện nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp. Do đó,
các phương pháp này khó ứng dụng trong chẩn đoán trên thực địa và phòng chống
khủng bố sinh học.
Hiện nay, đã có một số kỹ thuật dựa trên PCR dùng để xác định nhanh và
chính xác B. anthracis cũng như Y. pestis được phát triển với những ưu điểm nổi bật
như độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể thực hiện với các mẫu đã bất hoạt (nên chỉ