Nghiên Cứu Phát Triển Hệ Thống Phát Hiện Protein Dựa Trên Hệ Thống Vi Lưu Thao Tác Tập Trung Protein Tích Hợp Vi Cảm Biến Miễn Dịch Kiểu Tụ Phẳng

1

Vũ Quốc Tuấn

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG PHÁT HIỆN PROTEIN

DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG PROTEIN

TÍCH HỢP VI CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐIỆN TỬ VIỄN THÔNG

Hà Nội – 2021

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

1

Vũ Quốc Tuấn

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG PHÁT HIỆN PROTEIN

DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG PROTEIN

TÍCH HỢP VI CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG

Chuyên ngành: Kỹ thuật điện tử

Mã số: 9520203.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐIỆN TỬ VIỄN THÔNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS Bùi Thanh Tùng

2. GS.TS Chử Đức Trình

Hà Nội – 2021

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận án là công trình

nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Thanh Tùng và GS.TS

Chử Đức Trình. Các số liệu kết quả trong luận án hoàn toàn trung thực và

chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào trước đây. Các kết quả lấy từ các tài liệu

tham khảo đều được trích dẫn đầy đủ theo đúng quy trình.

Nội, ngày tháng năm 2021

Vũ Quốc Tuấn

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chử Đức Trình và PGS.TS Bùi

Thanh Tùng, đã giúp tôi định hướng và triển khai đề tài nghiên cứu. Với sự giúp đỡ

của các thầy, tôi đã thực hiện được các nội dung nghiên cứu, giải quyết các vấn đề

được đặt ra trong quá trình nghiên cứu và có được những kết quả quan trọng trong

luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Vi cơ điện tử và vi hệ

thống, Khoa Điện tử viễn thông và Trường Đại học Công nghệ, ĐHQGHN đã hỗ trợ

tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Tôi xin chân thành cảm ơn tiến sĩ Đỗ Quang Lộc, Trường đại học Khoa học Tự

nhiên, ĐHQGHN, đã có những thảo luận giá trị đóng góp cho luận án và hỗ trợ trong

quá trình chế tạo, thử nghiệm. Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn thạc sĩ Trần Như Trí,

Trường Đại học Công nghệ, ĐHQGHN đã hỗ trợ trong đo đạc thử nghiệm và thu thập

dữ liệu từ mạch đo kết nối với máy tính.

Cùng với đó, tôi xin chân thành cảm ơn giáo sư Chun-Pin Jen và thạc sỹ Meng￾Syuan Wu, Đại học quốc gia Chung Cheng, Đài Loan, đã có những hỗ trợ về nguyên

vật liệu, trang thiết bị, cũng như tham ra hỗ trợ nghiên cứu, chế tạo thử nghiệm. Tôi

cũng xin chân thành cảm ơn tiến sĩ Nguyễn Ngọc Việt đã hỗ trợ tôi trong quá trình

đo đạc trong thời gian làm nghiên cứu sinh tại Đại học Quốc gia Chung Cheng, Đài

Loan.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tôi trong những

lúc khó khăn để hoàn thành luận án này.

Vũ Quốc Tuấn

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. II

MỤC LỤC ......................................................................................................III

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT....................................................................VII

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................VIII

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................IX

MỞ ĐẦU............................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN

CHIP SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN PROTEIN ....................7

Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh và các kỹ

thuật xét nghiệm protein ..........................................................................................7

Vai trò của việc phát hiện protein trong chẩn đoán bệnh..................7

Kỹ thuật xét nghiệm ELISA..............................................................8

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC).....................................................9

Kỹ thuật đếm dòng chảy (flow cytometric) ......................................9

Kỹ thuật Protein microarrays ............................................................9

Kỹ thuật sử dụng kênh vi lỏng ........................................................10

Tổng quan các nghiên cứu về phát triển chip sinh học và chip phát

hiện protein .............................................................................................................11

Các nghiên cứu về chip sinh học ở trong nước ...............................12

iv

Các nghiên cứu về chip sinh học ở nước ngoài về phát hiện protein..

.........................................................................................................14

Chip vi kênh tập trung protein giúp giảm thời gian xét nghiệm và

tăng khả năng phát hiện protein............................................................................19

Dòng chảy điện di và dòng chảy điện thẩm....................................20

Làm giàu, làm nghèo ion.................................................................20

Chip vi kênh tập trung protein dựa trên nguyên lý dòng chảy EOF

và làm nghèo ion...................................................................................................23

Cảm biến sinh học kiểu trở kháng và tụ điện sử dụng các phương

pháp đo điện trong xét nghiệm sinh học và xét nghiệm protein...........................32

Kết luận chương.................................................................................34

CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ CHẾ TẠO HỆ THỐNG

PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP

TRUNG TÍCH HỢP CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG .................36

Hệ thống phát hiện protein với các chức năng tập trung, chọn lọc

và phát hiện .............................................................................................................36

Tập trung protein ..............................................................................41

Nguyên lý hoạt động của bộ tập trung protein................................41

Phương pháp tạo kênh nano bằng cách sử dụng điện áp thấp DC

đánh thủng lớp tiếp xúc.........................................................................................42

Chọn lọc và phát hiện protein sử dụng cảm biến miễn dịch kiểu tụ

phẳng tích hợp trong kênh vi lỏng.........................................................................44

Cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện phẳng..........................................44

Mô hình cảm biến miễn dịch kiểu tụ phẳng hai điện cực ...............46

Tụ bề mặt.........................................................................................48

Tính toán cho mô hình cảm biến tụ phẳng......................................48

v

Phương pháp đo phổ trở kháng (EIS) .............................................49

Nghiên cứu phát triển mạch đo phân tích trở kháng .......................51

Chế tạo chip vi kênh tập trung và phát hiện protein .....................58

Chế tạo kênh vi lỏng........................................................................58

Chế tạo điện cực trên kính, gắn nano vàng trên phiến kính............60

Gắn kênh vi lỏng lên chip ...............................................................61

Quy trình gắn kháng thể ..................................................................64

Kết quả chế tạo chip ..........................................................................66

2.5 Kết luận chương .......................................................................................67

CHƯƠNG 3. PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI

LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG TÍCH HỢP CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU

TỤ PHẲNG ................................................................................................69

Tập trung và phát hiện protein trên chip điện cực tròn................69

Cảm biến miễn dịch tụ phẳng điện cực tròn ...................................69

Thiết lập hệ đo.................................................................................70

Kết quả tập trung protein với chip kênh vi lỏng có tích hợp cảm

biến miễn dịch kiểu tụ phẳng cấu trúc điện cực tròn ở vùng tập trung ................71

Phát hiện protein trên chip vi kênh sau khi tập trung protein bằng

phương pháp đo trở kháng sử dụng mạch thiết kế................................................74

Phát hiện các lớp sinh hóa gắn trên điện cực vàng sử dụng cấu

trúc cảm biến răng lược..........................................................................................79

Cảm biến tụ phẳng kiểu răng lược tích hợp trong chip vi kênh tập

trung và phát hiện protein .....................................................................................80

Trở kháng bề mặt ở tần số cao ........................................................83

Mô hình đo tụ của cảm biến sinh học kiểu răng lược ở tần số cao .83

vi

Kết quả khảo sát cảm biến cấu trúc răng lược với các nồng độ muối

PBS khác nhau ......................................................................................................85

Phát hiện và theo dõi các lớp sinh hóa được hình thành trên điện

cực trong quá trình gắn kháng thể dựa trên phương pháp đo điện dung ở tần số

cao .........................................................................................................90

Kết quả tập trung và phát hiện protein trên chip có cấu trúc điện cực

hình răng lược .......................................................................................................95

Kết luận chương.................................................................................98

KẾT LUẬN ...................................................................................................101

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ...................................................103

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................104

PHỤ LỤC ......................................................................................................113

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt

1 ELISA Enzyme linked-immunosorbent

assay

Xét nghiệm ELISA

2 IHC Immunohistochemistry Xét nghiệm hóa mô miễn

dịch

3 EOF Electro-osmotic flow Dòng chảy điện thẩm

4 CPE Constant phase element Phần tử pha không đổi

5 EIS Electrical impedance spectroscopy Phổ trở kháng

6 IDEAs Integreted digitated electrode

arrays

Điện cực răng lược (nhiều

thanh điện cực xen kẽ)

7 LoC Lab on a Chip Phòng thí nghiệm trên chip

8 PDMS Polydimethylsiloxan Tên vật liệu

9 PBS Photpha salt solution Muối phốt phát

10 PoC Point of Care Chăm sóc sức khỏe tại chỗ

11 SNR Signal to Noise Ratio Tỉ lệ tín hiệu trên tạp

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Kích thước của cảm biến điện cực tròn..................................................................70

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Các phương pháp xét nghiệm protein dựa trên phương pháp xét nghiệm miễn

dịch. .........................................................................................................................8

Hình 1.2. Khái niệm của một chip sinh học được chia theo các thành phần chức năng. ....12

Hình 1.3. Cảm biến điện hóa dựa trên công nghệ in điện cực [73]. ...................................13

Hình 1.4. Cảm biến sinh học gắn kháng thể trong kênh vi lỏng sử dụng phương pháp đo

trở kháng [20]. .......................................................................................................16

Hình 1.5. Mô hình thiết kế và phát hiện các hạt sinh học dựa trên việc đếm số hạt đi qua

một cảm biến trở kháng [51]. ................................................................................17

Hình 1.6. Nguyên lý làm giàu, làm nghèo ion dựa trên cấu trúc kênh nano [59]..............21

Hình 1.7. Thiết kế của chip tập trung protein dùng màng lọc ion: (a) mô hình thiết kế của

chip vi kênh bao gồm hai kênh micro được liên kết với nhau bằng một màng lọc

ion; (b) sơ đồ nguyên lý chứng minh hoạt động của chip vi kênh khi vùng nghèo

ion sau đó dòng chảy protein được lái đến và bị tích lũy gần vùng nghèo ion

[39]. .......................................................................................................................24

Hình 1.8. Thiết kế chip trung protein dựa trên cấu trúc kênh vi lỏng sử dụng bộ lọc nano

tạo ra vùng nghèo ion dùng để bẫy protein [77]....................................................25

Hình 1.9. Cấu tạo của một chip vi kênh chế tạo bằng PDMS để tập trung protein [36]. ...26

Hình 1.10. Protein nồng độ 10 nM được tập trung lại theo thời gian được theo dõi bằng

phương pháp đo cường độ huỳnh quang với hai điện áp đặt vào hai kênh lần lượt

là 100 V và 200 V [36]..........................................................................................27

Hình 1.11. Protein được tập trung với các nồng độ thấp ban đầu khác nhau được khảo sát

hiệu suất tập trung trong thời gian khoảng 30 phút [36]. ......................................28

Hình 1.12. Cấu trúc chip vi lỏng với hai bước dùng để tập trung protein với 3 kênh lỏng

cỡ micro tạo nên cấu trúc đối xứng và cách nhau bởi khe 40 µm [38]. ................29

Hình 1.13. Mô tả cấu trúc chip tập trung protein bằng phương pháp đánh thủng điện áp:

(a)Thiết kế; (b) chế tạo; (c) hình thực tế của chip tập trung protein bằng cách sử

dụng hạt nano vàng chèn vào giữa lớp PDMS và kính nền [12]...........................31

Hình 2.1: Nghiên cứu giải pháp thực hiện chip xét nghiệm protein với ba chức năng tập

trung, chọn lọc và phát hiện. .................................................................................37

Hình 2.2: Mô hình thiết kế của chip tập trung và phát hiện protein: (a) các kênh vi lỏng

tập trung protein vào vùng bắt giữ nơi các kháng thể được cấy lên điện cực vàng,

protein đã bị bắt đặc hiệu được phát hiện bằng phương pháp đo trở kháng; (b)

cấu trúc thiết kế của chip, kháng thể cấy lên điện cực vàng trong kênh vi lỏng có

chiều cao 2 µm. .....................................................................................................39

Hình 2.3: Nguyên lý hoạt động của bộ tập trung protein dựa trên dòng chảy điện thẩm

và cấu trúc đứt gãy nano làm nghèo ion................................................................41

Hình 2.4: Cấu trúc đứt gãy nano được tạo ra trong chip hai kênh vi lỏng bằng cách cung

cấp nguồn DC điện áp cao để đánh thủng chỗ tiếp giáp của PDMS và tấm kính

x

ở khe giữa hai kênh: (a) sử dụng điện áp cao để tạo đứt gãy nano; (b) sử dụng

nano vàng gắn lên tấm kính chỗ khe giữa hai kênh để tạo cấu trúc đứt gãy.........43

Hình 2.5: Cấu trúc của một cảm biến biến miễn dịch kiểu tụ phẳng..................................45

Hình 2.6. Mô hình của cảm biến miễn dịch tụ phẳng hai điện cực: (a) mô hình điện của

cảm biến cấu trúc tụ phẳng hai điện cực; (b) mạch điện tương đương của cảm

biến. .......................................................................................................................47

Hình 2.7. Sơ đồ khối của mạch đo phổ trở kháng dải tần từ 10 kHz đến 200 kHz. ...........52

Hình 2.8. Khảo sát mạch đo phổ khuếch đại Lock-in với tín hiệu có cộng thêm nguồn

nhiễu trắng: tín hiệu 100 mVpk-pk trước và sau khi cộng với 2 Vpk-pk nhiễu trắng. 55

Hình 2.9. Kết quả khảo sát mạch đo: (a) sai số của bộ khuếch đại Lock-in ở dải tần từ 10

kHz đến 90 kHz với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp khác nhau; (b) sai số của bộ khuếch

đại ứng với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp. ....................................................................56

Hình 2.10. Kết quả sử dụng module đo phổ trở kháng để đo giá trị tụ 104 pF và trở 47

kΩ được mắc nối tiếp của mạch RC ở dải tần từ 10 kHz đến 200 kHz: (a) kết

quả đo tổng trở; (b) góc pha thay đổi; (c) giá trị điện trở R đo được trong mạch

mắc nối tiếp; (d) giá trị tụ điện đo được trong mạch mắc nối tiếp. .......................57

Hình 2.11. Quy trình chế tạo kênh vi lỏng..........................................................................59

Hình 2.12. Quy trình chế tạo chip bao gồm tạo điện cực, gắn hạt nano vàng và gắn vi

kênh lên chip. ........................................................................................................62

Hình 2.13. Thiết kế hệ gắn vi kênh lên chip có vùng nano vàng và điện cực; (a) hình mô

tả hai phần chip và vi kênh cùng với mô tả thiết bị gắn bao gồm phần dịch chuyển

và phần gắn lên vi kênh; (b) hình ảnh thực tế của hệ thống gắn kênh lên chip.....63

Hình 2.14. Quy trình gắn kháng thể bắt giữ protein lên điện cực vàng..............................65

Hình 2.15. (a) Chip sau khi được chế tạo; (b) Mô-đun đo kết nối với chip sau khi được

chế tạo....................................................................................................................66

Hình 3.1. Thiết kế cảm biến miễn dịch loại trở kháng hình dạng tròn: (a) kích thước và

hình dạng cảm biến tròn trong kênh vi lỏng; (b) kháng thể gắn lên trên điện cực

vàng để bắt giữ protein BSA. ................................................................................70

Hình 3.2. Quá trình tập trung protein của chip điện cực tròn thực hiện trong thời gian 30

phút........................................................................................................................72

Hình 3.3. Cường độ huỳnh quang tại vùng tập trung và phát hiện tăng lên trong quá trình

tập 2 µl mẫu chứa 10 µM protein BSA. ................................................................73

Hình 3.4. Chip vi kênh sau khi được gắn kháng thể và đo theo thời gian..........................74

Hình 3.5. Trở kháng thay đổi trước khi và sau khi tiến hành tập trung protein tại vùng có

cảm biến. ...............................................................................................................75

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn phần thực và phần ảo thay đổi theo tần số đo trên cảm biến

trước và sau khi tập trung. A) Đồ thị trở kháng phần phần thực. B) Đồ thị trở

kháng phần phức....................................................................................................76

xi

Hình 3.7. Kết quả thực nghiệm trên chip protein sau khi mạch đo được thiết kế lại: (a)

Tổng trở thay đổi trước và sau tập trung; (b) Tụ nối tiếp thay đổi trước và sau

tập trung.................................................................................................................77

Hình 3.8. Thiết kế của điện cực cấu trúc răng lược tích hợp trong kênh vi lỏng. ..............81

Hình 3.9. Mô hình cảm biến sinh học kiểu tụ răng lược: (a) các thành phần điện của mô

hình đo; (b) sơ đồ tương đương của mô hình đo. ..................................................85

Hình 3.10. Kết quả tổng trở kháng của 4 nồng độ muối PBS khác nhau lần lượt với 1mM,

5 mM, 10 mM và 20 mM khảo sát ở dải tần từ 1 kHz đến 1 MHz. ......................86

Hình 3.11. Đồ thị phần thực và phần ảo của cảm biến đo trên nồng độ muối 1 mM, 5

mM, 10 mM và 20 mM: (a) Phần thực; (b) phần ảo. ............................................88

Hình 3.12. Kết quả đo các nồng độ muối khác nhau ở tần số 1 MHz: (a) độ dẫn thay đổi

tương ứng với nồng độ muối PBS; (b) tụ nối tiếp tương đương thay đổi tương

ứng với nồng độ muối PBS ...................................................................................89

Hình 3.13. Các lớp sinh hóa có mặt trên bề mặt điện cực tương đương với các lớp điện

môi xếp chồng lên nhau tạo thành một mạch tụ nối tiếp.......................................91

Hình 3.14. Quá trình theo dõi các lớp sinh hóa PEG, EDC, ANTI, Biotin được cấy lên

bề mặt của cảm biến: (a) Phổ trở kháng thay đổi sau mỗi bước; (b) Tụ nối tiếp

thay đổi sau mỗi bước. ..........................................................................................93

Hình 3.15. Đồ thị phần thực và phần ảo của trở kháng thay đổi tương ứng với ba lớp Au,

PEG và EDC: (a) phần thực; (b) phần ảo. .............................................................94

Hình 3.16: Sự thay đổi trở kháng và tụ nối tiếp tương ứng với các lớp sinh hóa được gắn

lên lần lượt với Au(chip ban đầu), lớp PEG, EDC, Antibody (kháng thể), Biotin

và protein: (a) Tổng trở thay đổi ở 1MHz; (b) Tụ nối tiếp thay đổi ở 1MHz. ......97

Hình 3.17. Trở kháng và cường độ huỳnh quang thay đổi trong quá trình tập trung protein

ở điện cực răng lược. .............................................................................................98