Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ DỮ LIỆU CHUẨN

CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THƯỜNG DÙNG

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA GIÁM SÁT

CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU VÀ THUỐC ĐÔNG DƯỢC

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn Tựu

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

7374

25/5/2009

NĂM 2009

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ DỮ LIỆU CHUẨN

CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THƯỜNG DÙNG

PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA GIÁM SÁT

CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU VÀ THUỐC ĐÔNG DƯỢC

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn Tựu

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

Cấp quản lý: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện: Từ tháng 8/2006 đến tháng 1/2009

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 400 triệu đồng

Trong đó: Kinh phí SNKH 400 triệu đồng

NĂM 2009

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1. Tên đề tài: Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường

dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn Tựu

3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

4. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế

5.Thư ký đề tài: ThS. Phạm Thị Giảng

6. Danh sách những người thực hiện chính:

− TS. Nguyễn Văn Tựu: Chủ nhiệm đề tài

− PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu: Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

− ThS. Phạm Thị Giảng: Thư ký đề tài

− ThS. Nguyễn Tuấn Anh: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS. Trịnh Thị Quy: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− ThS. Nguyễn Đức Toàn: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS. Nguyễn Thị Lan Phương: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện

KNTTW

− Ds. Nguyễn Việt Hà: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− ThS. Nguyễn Thị Phương Thảo: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện

KNTTW

− CN. Ngô Văn Trại: Khoa Tài nguyên, Viện Dược liệu

− DS. Trần Thị Thu Trang: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS. Trần Thị Thu Hương: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

− DS. Đỗ Thị Bích Thuận: Khoa KN Đông dược - Dược liệu, Viện KNTTW

7. Thời gian thực hiện: Từ tháng 8/2006 đến tháng 01/2009

NHỮNG CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

ADN Acid deoxyribonucleic

BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh )

CP Pharmacopoeia of the Peoples’s Republic of China, English editon,

(Dược điển Trung Quốc, bản tiếng Anh)

C18 Octadecyl

CHCl3 Cloroform

DAD Diode array Detector (detector chuỗi Diod)

DĐVN III Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ ba

ELSD Evaporative light - scattering detector (Detector tán xạ ánh sáng

bay hơi)

EA Ethyl acetat

EtOH Ethanol

FTIR Fourier Transform Infrared Spectra (Phổ hồng ngoại chuyển hóa

Fourier)

GACP Good Agricultural and Collection Practice (Thực hành nuôi trồng

và thu hái tốt)

GC Gas chromatography (Sắc ký khí)

GC-MS Gas chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí khối phổ)

GSP Good Store Pratice (Thực hành bảo quản tốt)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng

cao)

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng

hiệu năng cao)

IR Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại)

JP The Japanese Pharmacopoeia, Fourteeth Edition (Dược điển Nhật )

MS Mass Spectra (Phổ khối)

MeOH Methanol

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

µm Micromet

µl Microlit

Rf Giá trị Rf

RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

TR Retention time (Thời gian lưu)

UV – VIS Ultraviolet and Visible absorption Spectrophotometry (Phổ hấp thụ

tử ngoại khả kiến)

USP The united States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 30)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

MỤC LỤC

Trang

Phần A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI …….... 1

1 Kết quả nổi bật của đề tài……………………………………….. 1

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội…………….. 2

3 Đánh giá tình hình thực hiện đề tài so với đề cương đã được phê

duyệt………………………………………………………..........

3

4 Các ý kiến đề xuất………………………………………………. 3

Phần B NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN

CỨU……………………………………………………………..

4

1 ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………….. 4

2 TỔNG QUAN………………………………………………….. 6

2.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn

của các dược liệu ……………………………………………....

6

2.2 Tổng quan về một số phương pháp liên quan……………...... 7

2.2.1 Phương pháp cảm quan ……………………………………….... 7

2.2.2 Phương pháp sử dụng kính hiển vi ……………………………... 8

2.2.2.1. Phương pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu ...................................... 8

2.2.2.2. Phương pháp soi bột dược liệu ..................................................... 8

2.2.3. Một số phương pháp sắc ký ……………………………………. 8

2.2.3.1. Phương pháp TLC và phương pháp HPTLC................................ 8

2.2.3.2 Phương pháp HPLC ..................................................................... 10

2.2.3.3. Phương pháp GC .......................................................................... 12

2.3. Tổng quan về một số nhóm hợp chất chính thường gặp

trong dược liệu ………………………………………………...

14

2.3.1 Terpenoid ……………………………………………………..... 15

2.3.1.1 Monoterpen và sesquiterpen…………………………………..... 15

2.3.1.2 Mono và diterpenoid glycosid …………………………………. 16

2.3.1.3 Triterpenoid và steroid ………………………………………..... 16

2.3.1.4. Saponin …………………………………………….................... 16

2.3.2. Alcaloid ……………………………………………................... 18

2.3.3. Hợp chất phenol……………………………………………….... 19

2.3.3.1. Flavonoid ………………………………………………………. 19

2.3.3.2. Coumarin …………………………………………….................. 20

2.3.3.3. Lignan ……………………………………………...................... 20

2.3.3.4. Các acid phenolic ……………………………………………..... 20

2.3.3.5. Anthranoid ……………………………………………............... 21

2.4. Tổng quan về thành phần hóa học và một số phương pháp

kiểm tra chất lượng của 30 dược liệu nghiên cứu …………...

21

2.5. Tổng quan về hesperidin, emodin và geniposid ...................... 30

2.5.1. Hesperidin .................................................................................... 30

2.5.2 Geniposid ..................................................................................... 31

2.5.3 Emodin ......................................................................................... 31

2.6. Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế

một số hợp chất liên quan ……………………………….

32

2.6.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế flavonoid và

hesperidin ...............................................................................

32

2.6.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế anthranoid và

emodin ………………………………………………………

33

2.6.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế iridoid glycosid và

geniposid ……………………………………………………….

33

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …….... 34

3.1. Thiết kế nghiên cứu …………………………………………... 34

3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu ………………... 34

3.2.1. Chọn mẫu ………………………………………………………. 34

3.2.2. Cỡ mẫu …………………………………………………………. 34

3.2.3. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………….. 34

3.2.4. Các chất chuẩn đối chiếu hoặc chất đánh dấu ............................. 35

3.3. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………... 36

3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu …………………………………………...... 36

3.3.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………..... 36

3.4. Trang thiết bị, dung môi hóa chất ………………………….... 47

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ……………........ 48

4.1 Thu thập, xác định tên khoa học mẫu dược liệu chuẩn ……. 48

4.2. Theo dõi,bảo quản và lưu giữ các mẫu dược liệu nghiên cứu 48

4.3 Phân tích các đặc điểm vi học và thành phần hóa học của

các dược liệu …………………………………………………...

49

4.3.1. Bạch thược 50

4.3.2 Bạch truật 59

4.3.3. Bán hạ bắc 69

4.3.4. Cát sâm 76

4.3.5. Chỉ thực 83

4.3.6. Chi tử (Dành dành) 96

4.3.7. Diệp hạ châu 107

4.3.8. Cúc gai 120

4.3.9. Cây Hoa ngũ sắc (Cây Cứt lợn) 129

4.3.10. Đại hoàng 141

4.3.11 Đại hồi 153

4.3.12 Đan sâm 164

4.3.13. Địa cốt bì 174

4.3.14. Diệp hạ châu đắng 184

4.3.15 Đương quy 197

4.3.16 Hạ khô thảo 210

4.3.17. Hoàng đằng 218

4.3.18. Hương phụ 226

4.3.19. Kê huyết đằng 239

4.3.20. Kim ngân hoa 248

4.3.21. Mã tiền 257

4.3.22. Mẫu đơn bì 267

4.3.23. Mộc thông 277

4.3.24 Nghệ 286

4.3.25. Ngưu tất 297

4.3.26 Quế 306

4.3.27. Riềng 317

4.3.28. Sa nhân 326

4.3.29. Thăng ma 338

4.3.30. Trần bì 347

4.4 Phương pháp chiết tách, tinh chế emodin, hesperidin và

geniposid từ các dược liệu nghiên cứu để làm chuẩn …….…

358

4.4.1 Chiết tách, tinh chế emodin từ thân rễ đại hoàng …………….... 358

4.4.2 Chiết tách và tinh chế hesperidin từ trần bì …………………..... 361

4.4.3. Chiết tách và tinh chế geniposid từ quả dành dành …………..... 365

5 KẾT LUẬN …………………………….................................... 369

TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………..... 372

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả xác định tên khoa học của 30 dược liệu

nghiên cứu

Phụ lục 2: Một số thuốc thử đã dùng để phát hiện các nhóm chất

và cách pha

Phụ lục 3: Quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu

Phụ lục 4: Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế hesperidin

từ trần bì

Phụ lục 5: Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế emodin từ

đại hoàng

Phụ lục 6: Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế geniposid

từ quả dành dành

Phụ lục 7: Các phổ nmr, ms, ir của hesperidin, emodin và

geniposid

Phụ lục 8: Danh mục các sản phẩm của đề tài

Phụ lục 9: Dự thảo tiêu chuẩn của hesperidin, emodin và

geniposid

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 1

PHẦN A - TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1. KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

a. Đóng góp mới của đề tài

− Đã thu thập và xác định đúng tên khoa học, đúng bộ phận dùng của 30 dược

liệu nghiên cứu và một số loài khác để so sánh.

− Xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu đã thu thập được khác với

các dược liệu đã được nghiên cứu trước đây về cùng khía cạnh nghiên cứu,

qua đó đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu nói chung.

− Bộ dữ liệu bao gồm 30 mẫu dược liệu được định danh đúng và các đặc điểm

về hình thái bên ngoài, bột, vi phẫu và các đặc điểm hóa học đặc trưng thông

qua các sắc ký đồ dấu vân tay. Dữ liệu được lưu dưới dạng atlas nên có tính

khách quan và khoa học.

− Lần đầu tiên đề tài đã kết hợp nhiều phương pháp và kỹ thuật phân tích khác

nhau từ các kỹ thuật thường quy như TLC... đến các kỹ thuật hiện đại như

HPTLC, HPLC với detector UV-VIS và detector DAD, ELSD, GC và GC￾MS, có so sánh với các chất đối chiếu tinh khiết.

− Chiết xuất, phân lập được 3 chất đối chiếu: Hesperidin, geniposid và emodin

từ các dược liệu trần bì, dành dành và đại hoàng đạt yêu cầu về độ tinh khiết

làm chuẩn.

− Dùng các chất đối chiếu đã phân lập được để làm chuẩn so sánh trong phân

tích định tính trần bì, dành dành và đại hoàng bằng phương pháp TLC,

HPLC.

b. Kết quả cụ thể

− Đưa ra mẫu dược liệu đúng của 30 dược liệu và các dữ liệu (hình ảnh về hình

thái, vi phẫu, bột, sắc ký đồ TLC, HPLC, GC)

− Xây dựng được phương pháp chiết và phân tích TLC, HPLC và GC để xác

định đặc điểm “dấu vân tay” đặc trưng của từng dược liệu.

− Xây dựng được quy trình chiết xuất, phân lập 3 chất đối chiếu từ các dược

liệu nghiên cứu.

− Sản phẩm của 3 chất đối chiếu đã chiết xuất và phân lập đạt yêu cầu tinh

khiết để làm chuẩn: Hesperidin, geniposid và emodin cùng các hồ sơ liên

quan (các phổ xác định cấu trúc...)

− Quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn đối với dược liệu.

Các sản phẩm hiện đang được lưu giữ tại Khoa Kiểm nghiệm Đông dược -

Dược liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Danh mục các sản phẩm của đề tài ghi ở phụ lục 8.

c. Hiệu quả về đào tạo:

− Góp phần đào tạo 2 thạc sỹ dược học:

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 2

c Đỗ Thị Thanh Thủy Năm tốt nghiệp: 2008

+Tên đề tài: “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn emodin từ đại hoàng

phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc”

d Nguyễn Việt Hà Năm tốt nghiệp: 2009

Tên đề tài: “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn geniposid từ quả dành

dành phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc”

− Góp phần đào tạo 1 dược sỹ đại học:

+ Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Hương Thơm Năm tốt nghiệp: 2007

Tên đề tài: “Nghiên cứu xây dựng chất chuẩn Hesperidin và ứng dụng

trong kiểm nghiệm thuốc”

− Đào tạo một số cán bộ mới của Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu

thông qua các nội dung nghiên cứu của đề tài

− Tham gia đào tạo nhiều lượt cán bộ làm công tác kiểm nghiệm dược liệu và

thuốc đông dược của các Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm và

các công ty Dược.

− Đã công bố được 2 bài báo trên tạp chí Kiểm nghiệm thuốc.

d. Hiệu quả về kinh tế

Kết quả nghiên cứu của đề tài được lưu lại dưới dạng hình ảnh có thể là tư

liệu tham khảo thay thế trong trường hợp thiếu dược liệu chuẩn khi kiểm tra chất

lượng dược liệu. Các sản phẩm phân lập được từ dược liệu có thể dùng làm

chuẩn phòng thí nghiệm, tiết kiệm hơn khi mua chuẩn.

e. Hiệu quả về mặt xã hội

Kết quả của đề tài có thể được ứng dụng vào công tác kiểm tra, giám sát

chất lượng dược liệu, qua đó, góp phần quản lý tốt chất lượng dược liệu và chế

phẩm đông dược, hạn chế tình trạng dược liệu giả mạo hiện nay

f. Hiệu quả khác

Đề tài góp phần bổ sung nguồn dữ liệu vào kho dữ liệu chuẩn của dược

liệu lưu hành tại Việt Nam, làm cơ sở cho việc xây dựng, soát xét các chuyên

luận của Dược điển Việt Nam.

2. ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã và đang được áp dụng trong phân tích,

kiểm tra chất lượng dược liệu và các thành phẩm đông dược tại Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung ương và hệ thống kiểm tra giám sát chất lượng thuốc trong

cả nước góp phần nâng cao chất lượng đông dược và thuốc đông dược.

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 3

3. ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI SO VỚI ĐỀ CƯƠNG

ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT

a. Tiến độ

+ Đúng tiến độ +

Đề tài đã được thực hiện đúng tiến độ: Từ 8/2006 đến tháng 01 / 2009

b. Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra

+ Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra: +

− Xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu thường dùng ở Việt

Nam hiện chưa có hoặc thiếu các dữ liệu tin cậy phục vụ công tác

kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược.

− Chiết xuất, phân lập và tinh chế được 3 chất đối chiếu đạt yêu cầu làm

chất đối chiếu từ các dược liệu trên.

− Đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu.

c. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương

+ Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương +

Đề tài đã tạo ra đầy đủ các sản phẩm như đã nêu ở mục b theo đúng dự

kiến trong bản đề cương. Ngoài ra, còn xây dựng tiêu chuẩn dự thảo đối với

3 chất phân lập được.

d. Đánh giá viêc sử dụng kinh phí

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 400 triệu đồng

Trong đó: Kinh phí sự nghiệp khoa học: 400 triệu đồng

Kinh phí từ nguồn khác: Không

Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán.

4. CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT

− Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của đề tài và quy trình thiết lập dữ liệu

chuẩn của dược liệu, có thể tiếp tục nghiên cứu áp dụng trên nhiều dược liệu

khác

− Triển khai ứng dụng nghiên cứu chỉ thị ADN của dược liệu để bổ sung dữ

liệu về đặc tính di truyền, giúp cho việc định danh và định tính dược liệu

được chính xác hơn.

− Từ các kết quả nghiên cứu của một số đề tài về chuẩn dược liệu và dấu vân

tay sắc ký, hội đồng Dược điển nên tập hợp toàn bộ những dữ liệu chuẩn này

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 4

để tiến tới hoàn chỉnh bộ dữ liệu chuẩn của dược liệu lưu hành tại Việt Nam

và làm cơ sở xây dựng, sóat xét và thẩm định một số chuyên luận dược liệu.

− Tiếp tục triển khai nghiên cứu thiết lập chất chuẩn từ dược liệu với quy mô

lớn hơn để cung cấp nguồn chuẩn cho các cơ sở kiểm tra, giám sát chất lượng

dược liệu và thuốc đông dược.

PHẦN B- NỘI DUNG CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, việc sử dụng thuốc từ dược liệu có xu hướng

gia tăng trên phạm vi toàn cầu, không chỉ đối với phần đông dân số ở các nước

đang phát triển mà còn cả ở những nước phát triển. Ở Mỹ, số đơn thuốc có sử

dụng hoạt chất từ dược thảo chiếm 25% tổng số đơn thuốc pha chế tại cửa hàng;

hàng năm Trung Quốc sử dụng khoảng 700.000 tấn dược liệu và sản xuất

khoảng 6.266 mặt hàng; giá trị buôn bán dược liệu ở Ấn Độ hàng năm đạt hơn

60 tỷ Rupi... [12].

Ở nước ta, việc sản xuất, kinh doanh các mặt hàng thuốc có nguồn gốc từ

dược liệu tăng lên không ngừng. Theo thống kê của Cục quản lý dược Bộ Y tế,

tính đến tháng 5 năm 2007, cả nước đã có hơn 3000 mặt hàng thuốc có nguồn

gốc dược liệu đã được Bộ Y tế cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 tổng số thuốc sản

xuất trong nước đã được cấp số đăng ký [24]. Thị trường dược liệu và các sản

phẩm từ dược liệu cũng vì thế rất đa dạng và phong phú về nguồn gốc và chủng

loại. Do đó nhu cầu về dược liệu rất lớn, hàng năm nước ta tiêu thụ từ 30 -

50.000 tấn dược liệu các loại [25]. Trong khi đó, chất lượng dược liệu đang là

vấn đề bức xúc không chỉ đối với các cơ quan quản lý mà còn của toàn ngành Y

tế cũng như của cả cộng đồng. Dược liệu dùng làm thuốc được cung cấp từ

nguồn thu hái hoang dại, trồng trọt và nhập khẩu. Nguồn dược liệu sản xuất

trong nước hiện nay mới đáp ứng được 46% nhu cầu của thị trường [6], còn

khoảng 60% phải nhập khẩu. Nguồn nhập khẩu chủ yếu theo con đường tiểu

ngạch, thiếu kiểm sóat. Do nguồn gốc dược liệu phức tạp, không rõ ràng, số

lượng lại lớn khó kiểm sóat dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, nhầm lẫn, kém

chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng không tốt

đến độ an toàn, hiệu lực và chất lượng của các chế phẩm từ dược liệu

Trước thực trạng trên, đã có nhiều đề tài, hội nghị, bài báo về vấn đề quản

lý chất lượng dược liệu nhưng tình hình chất lượng dược liệu chưa có chuyển

biến đáng kể [20]. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng dược liệu trong giai đoạn

hiện nay cần phải được đẩy mạnh hơn bao giờ hết. Trong mấy năm gần đây,Bộ

Y tế cũng đã quan tâm nhiều đến vấn đề này và đã cấp kinh phí cho dự án nâng

cao năng lực phòng kiểm tra chất lượng đông dược, dược liệu. Song đối với việc

kiểm tra chất lượng thuốc nói chung và kiểm tra chất lượng dược liệu nói riêng,

bên cạnh trang thiết bị hiện đại, cần phải có chất chuẩn đối chiếu.

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 5

Mặt khác, đối với dược liệu,muốn áp dụng tiêu chuẩn DĐVN III để định

tính, định lượng các hoạt chất hoặc chất đặc trưng, cần phải có chuẩn dược liệu

hay chất đối chiếu hóa học là hoạt chất hay chất đặc trưng của dược liệu đó để

so sánh mà những chuẩn này thực tế còn thiếu chưa đáp ứng được. Vì thế, việc

kiểm tra chất lượng dược liệu ở nhiều nơi chủ yếu chỉ dừng lại ở mức độ cảm

quan, dựa vào kinh nghiệm hay làm một số phản ứng hoa học thông thường nên

kết quả đánh giá chất lượng còn hạn chế. Hiện nay, đã có một số công trình

nghiên cứu của Viện Dược liệu, Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trường Đại

học dược [4,16,22]... nhằm cung cấp những dữ liệu chuẩn về dược liệu khắc

phục phần nào những khó khăn về chuẩn. Song các công trình nghiên cứu này

mới chỉ khảo sát trên một số dược liệu với một số khía cạnh nhất định như vi

phẫu, bột, TLC hoặc HPLC và còn hàng trăm dược liệu khác chưa được khảo sát

hoặc khảo sát chưa đầy đủ. Ngoài ra, đã có không ít đề tài nghiên cứu chiết xuất

và phân lập được các chất đặc trưng từ dược liệu, một số ít trong đó có thể dùng

làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc nhưng nhìn chung việc nghiên cứu

chiết xuất, phân lập hoạt chất từ dược liệu nhằm đạt yêu cầu làm chuẩn vẫn còn

ít, chưa đáp ứng được nhu cầu về chất chuẩn trong kiểm nghiệm thuốc có nguồn

gốc từ dược liệu.

Để góp phần phát triển, bổ sung thêm nguồn dữ liệu chuẩn của các dược

liệu thường dùng và chất đối chiếu từ dược liệu phục vụ việc kiểm tra giám sát

chất lượng dược liệu và thuốc đông dược, trên cơ sở kết quả đạt được của đề tài

cấp cơ sở đã được nghiệm thu 2003-2005, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên

cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công

tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược”.

Mục tiêu của đề tài :

− Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu thường dùng ở Việt Nam mà

chưa có hoặc thiếu các dữ liệu tin cậy về chất lượng phục vụ công tác kiểm

tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược.

− Chiết xuất, phân lập ít nhất 3 chất đối chiếu từ các dược liệu nghiên cứu đạt

yêu cầu làm chất đối chiếu.

− Đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu.

Nội dung nghiên cứu:

− Thu thập, định danh 30 dược liệu nghiên cứu

− Phân tích các đặc điểm hình thái, vi học của 30 dược liệu nghiên cứu

− Phân tích các đặc điểm hóa học đặc trưng của 30 dược liệu trên bằng phương

pháp TLC,HPLC và /hoặc GC-MS. Từ các sắc ký đồ thu được lựa chọn các

đặc điểm đặc trưng làm dấu vân tay sắc ký cho các dược liệu.

− Tập hợp các dữ liệu phân tích thành file dữ liệu cho mỗi dược liệu nghiên

cứu.

− Lưu trữ và bảo quản cơ sở dữ liệu thu thập được vào đĩa CD.

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 6

− Đóng gói, theo dõi, bảo quản các mẫu dược liệu nghiên cứu trong điều kiện

phòng thí nghiệm, đưa ra nhận xét về thời hạn bảo quản thích hợp ở điều kiện

phòng thí nghiệm đối với dược liệu nghiên cứu.

− Từ kết quả nghiên cứu đưa ra quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn cho một dược

liệu.

− Chiết xuất, phân lập và tinh chế 3 chất hesperidin, emodin và geniposid từ

trần bì, đại hoàng và dành dành để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm

nghiệm đông dược dược liệu. Xác định cấu trúc các chất phân lập được.

2. TỔNG QUAN

2.1. Tổng quan về tình hình nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của các

dược liệu

Để tiến hành nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu, vấn đề đầu tiên có tính

chất quyết định là phải đảm bảo tính đúng của dược liệu, có nghĩa là dược liệu

đó phải được định danh đúng tên, đúng loài, đúng bộ phận dùng [24]. Cần tiêu

chuẩn hóa và ghi lại các đặc điểm về hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột, các đặc

điểm hóa học đặc trưng để thể hiện tính đúng đó. Tập hợp những đặc điểm thể

hiện tính đúng của dược liệu được coi là dữ liệu chuẩn của dược liệu. Dữ liệu

chuẩn có thể góp phần làm căn cứ để định tính, phòng chống giả mạo, nhẫm lẫn,

tiêu chuẩn hóa, kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng.

Do đó, việc nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của dược liệu đã và đang được

chú ý nhiều không chỉ ở nước ta mà còn ở các nước trên thế giới.

Trước kia, trong các chuyên luận dược liệu, để định tính dược liệu, dược

điển các nước chỉ đưa ra yêu cầu về đặc điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột

của dược liệu và một số phản ứng hóa học đặc trưng bằng phản ứng trong ống

nghiệm hoặc bằng kỹ thuật TLC. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ

thuật,việc sử dụng kỹ thuật số để chụp lại ảnh của dược liệu hay đặc điểm vi

phẫu, bột dược liệu dưới kính hiển vi làm dữ liệu chuẩn về mặt thực vật của

dược liệu đã trở nên phổ biến. Để ghi lại các đặc điểm đặc trưng của dược liệu,

người ta sử dụng kỹ thuật điểm chỉ dấu vân tay (fingeprint) như dấu vân tay hóa

học, dấu vân tay ADN bằng các phương pháp phân tích hiện đại như phương

pháp sắc ký, điện di, quang phổ, nhiễu xạ tia X, phân tích gen

[33,36,41,42,67,73,99]... hoăc kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.Trong

những phương pháp trên, sắc ký như TLC, HPTLC, HPLC, GC hoặc sắc ký kết

hợp phương pháp đo phổ như LC-MS, GC-MS, FTIR, HPLC-DAD... là phương

pháp hay được sử dụng nhất để định tính và kiểm tra chất lượng dược liệu

[44,45,46,53,58,115]... Các dấu vân tay sắc ký là các sắc ký đồ chỉ ra các đặc

trưng hóa học đa thành phần của dược liệu. Vì vậy, trong những năm gần đây,

bên cạnh TLC,dược điển các nước như USP, BP, CP, JP... đã có nhiều chuyên

luận dược liệu và chế phẩm đông dược áp dụng phương pháp HPLC, GC hay

HPTLC trong định tính, định lượng hoạt chất hay nhóm chất đặc trưng của dược

liệu.

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 7

Trên thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành thu thập mẫu dược liệu và

nghiên cứu về các mặt thực vật học, hóa học và đưa ra các dữ liệu dưới dạng

atlas.

Ở Đức và Ấn Độ, việc nghiên cứu thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu

nhằm tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu và các thuốc từ dược liệu

đã sớm được quan tâm. Tính đến năm 2002, cuốn sách “Herbal Drugs and

Phytopharmaceuticals” của Max Wichtl đã được xuất bản 4 lần bằng tiếng Đức,

trong đó đưa ra các ảnh chụp về đặc điểm hình thái và sắc ký đồ TLC [102].

Năm 1996, 2 tác giả người Đức là H.Wagner và S. Bladl đã cho ra mắt lần thứ

nhất Atlas TLC của 170 dược liệu và đến năm 2001 xuất bản lần 2 với 230 dược

liệu [93].

Năm 2002, Pulok K Mukhejee, khoa Công nghệ Dược phẩm, trường Đại học

Jadavpur, Kolkata, Ấn Độ đã nghiên cứu đưa ra các hình ảnh về đặc điểm hình

thái và sắc ký đồ TLC của các chất đặc trưng của 25 vị dược liệu ở Ấn Độ [78].

Trung Quốc là một nước đóng góp nhiều công trình khoa học nghiên cứu

về dược liệu, đặc biệt về lĩnh vực phân tích đặc điểm hóa học, đặc điểm di

truyền, thiết lập dấu vân tay hóa học, dấu vân tay ADN... coi đó là phương tiện

hữu hiệu để so sánh, phân loại, định tính và đánh giá chất lượng dược liệu

[33,71,105,106]...

Năm 2005, Hồng Kông Trung Quốc đã xuất bản tập 1 bản tiêu chuẩn của

8 dược liệu trồng tại Hồng Kông, tiếp đó 7/2008 tập 2 ra đời với 24 chuyên luận

dược liệu. Các chuyên luận này bao gồm những hình ảnh về hình thái bên ngoài,

vi phẫu, sắc ký đồ của HPLC phân tích các chất đặc trưng đại diện cho các dược

liệu trong tiêu chuẩn [38].

Ở nước ta, việc nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu cũng đã được Bộ Y

tế quan tâm, chỉ đạo nhiều, đặc biệt trong mấy năm gần đây, đã có không ít các

đề tài nghiên cứu về vấn đề này đã công bố hoặc đang trong giai đoạn thực hiện.

Năm 2002, Nguyễn Viết Thân đã cho ra mắt tập 1 quyển “Kiểm nghiệm

dược liệu bằng phương pháp hiển vi”, trong đó có ảnh màu chụp cây thuốc, vị

thuốc, vi phẫu, bột của 100 dược liệu [20]. Năm 2005, Trịnh Văn Quỳ và cộng

sự đã công bố các dữ liệu chuẩn bao gồm ảnh chụp vị thuốc,vi phẫu, bột và sắc

ký đồ TLC của 25 dược liệu và sắc ký đồ HPLC, GC-MS của 11 dược liệu [16].

Tiếp theo, Nguyễn Kim Bích và cộng sự đã phân tích dấu vân tay TLC của 20

dược liệu [4], Nguyễn Thị Bích Thu đã phân tích dấu vân tay HPLC của 10

dược liệu [22]... Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu xây dựng chỉ thị dấu vân tay

ADN của một số dược liệu và coi đó là một đặc trưng của dược liệu cần kiểm tra

khi định tính [17].

2.2. Tổng quan về một số phương pháp liên quan

Phương pháp kiểm tra chất lượng dược liệu nói chung đã được WHO và

dược điển các nước quy định bao gồm các phương pháp kiểm tra đặc điểm hình

thái bên ngoài, vi phẫu, bột, định tính, định lượng hoạt chất hoặc chất hay nhóm

chất đặc trưng, thử tinh khiết [2,31,51,77,78,103].

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009

________________________________________________________________________ 8

Để kiểm tra tính xác thực của dược liệu, người ta kiểm tra về các đặc

điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột và định tính bằng các phép thử hóa học,

quang phổ, sắc ký, chỉ thị ADN... Cho đến nay, phương pháp dùng chỉ thị ADN

đã được áp trong kiểm tra chất lượng dược liệu ở một số nước trên thế giới

nhưng ở nước ta phương pháp này chưa được nghiên cứu nhiều.

2.2.1. Phương pháp cảm quan

Là phương pháp dùng các giác quan để kiểm tra về hình dáng, màu sắc,

đặc điểm vết bẻ ngang, mùi vị, dùng thước để xác định kích thước của dược liệu.

Đây là phương pháp đơn giản và nhanh nhất để định tính, đánh giá sơ bộ về mặt

chất lượng dược liệu. Tuy nhiên, khi mẫu dược liệu thay thế hoặc giả mạo có

đặc điểm bên ngoài rất giống mẫu dược liệu thật thì cần thiết phải áp dụng các

phương pháp khác [1].

2.2.2. Phương pháp sử dụng kính hiển vi

Là phương pháp sử dụng kính hiển vi để nhận biết các đặc điểm của các

mô, tế bào, hoặc các chất chứa trong tế bào, ở các lát cắt, bột, các mô đã được

làm rã ra hoặc các tiêu bản bề mặt của dược liệu. Phương pháp thông dụng nhất

là phương pháp soi vi phẫu và soi bột.

2.2.2.1. Phương pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu

Cắt dược liệu thành những lát mỏng theo chiều ngang hoặc dọc bằng lưỡi

dao cạo, ống cắt vi phẫu cầm tay hay máy cắt vi phẫu, đem soi ngay lát cắt hoặc

xử lý lần lượt với cloramin T 5%, cloral hydrat, dung dịch acid acetic 1%, nước

cất rồi nhuộm với dung dịch xanh methylen và dung dịch đỏ carmin, sau đó soi

dưới kính hiển vi.

2.2.2.2. Phương pháp soi bột dược liệu

Nghiền dược liệu thành bột mịn, cho một lượng nhỏ bột vào một giọt

dung dịch soi như nước cất, glycerin, cloral hydrat...trên lam kính, khuấy kỹ và

cẩn thận bằng kim mũi mác, đậy lam kính, di nhẹ rồi quan sát dưới kính hiển vi

2.2.3. Một số phương pháp sắc ký

2.2.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng

cao (HPTLC)

TLC là một phương pháp tách mà trong đó pha tĩnh là một chất rắn thích

hợp (có thể là silicagel, silicagel đã silan hóa, nhôm oxyd, cellulose...) được trải

thành một lớp mỏng,mịn và đồng nhất trên bề mặt phiến kính, kim loại hay

nhựa; pha động là một chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi phối hợp với

nhau. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được chấm riêng biệt trên cùng một

đường thẳng trên bản mỏng. Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển

qua pha tĩnh mà trên đó đã đặt các chất cần tách. Các thành phần trong hỗn hợp