Nghiên cứu kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser trong một số chỉ định trên bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ LIÊN HƯƠNG

NGHI£N CøU Kü THUËT Hç TRî PH¤I THO¸T MµNG

B»NG TIA LASER TRONG MéT Sè CHØ §ÞNH

TR£N BÖNH NH¢N THô TINH TRONG èNG NGHIÖM

Chuyên ngành : Mô phôi thai học

Mã số : 62720103

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Hà nội - 2013

2

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) hiện nay đang rất phát

triển ở Việt Nam. Với kỹ thuật này, mặc dù phôi đã đƣợc nuôi cấy thành công

ngoài cơ thể, nhƣng khi cấy vào tử cung, khả năng bám vào niêm mạc tử cung

làm tổ của phôi chỉ đạt trung bình khoảng 20%, tỷ lệ thai lâm sàng khoảng

35% và tỷ lệ em bé sinh ra còn thấp hơn nữa [66]. Có rất nhiều yếu tố ảnh

hƣởng đến khả năng làm tổ của phôi. Trong đó, một yếu tố quyết định là phôi

phải thoát ra khỏi đƣợc màng trong suốt. Năm 1989, Cohen và cộng sự đã

chứng minh rằng việc tạo một lỗ thủng trên màng trong suốt sẽ giúp phôi

TTTON thoát màng dễ hơn và tỉ lệ làm tổ của phôi sẽ cao hơn. Kỹ thuật này

đƣợc các tác giả đặt tên là kỹ thuật ―hỗ trợ thoát màng‖ (assisted hatching￾AH) [trích dẫn 39].

Có ba cơ chế có thể giải thích hiệu quả của hỗ trợ phôi thoát màng: (1)

Trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo kéo dài hoặc đông lạnh, màng trong suốt bị

cứng chắc bất thƣờng hoặc không mỏng đi trong quá trình phôi phát triển, làm

cho phôi không thể thoát ra ngoài và bám vào nội mạc tử cung để làm tổ [33],

[41]. (2) Hỗ trợ phôi thoát màng giúp phôi thoát màng sớm hơn, phù hợp với

―cửa sổ làm tổ‖ của niêm mạc tử cung sớm hơn 1-2 ngày của chu kỳ kích

thích buồng trứng so với chu kỳ tự nhiên [114]. (3) Mở màng trong suốt nhân

tạo có thể tạo một kênh trao đổi các chất chuyển hóa, các yếu tố tăng trƣởng

và các ―tín hiệu dẫn truyền‖ giữa phôi và niêm mạc tử cung [34].

Có nhiều phƣơng pháp hỗ trợ phôi thoát màng, có thể làm mỏng hay

làm thủng màng trong suốt của phôi bằng cơ học, hóa chất hoặc bằng tia laser.

Tuy nhiên, kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser hiện đƣợc nhiều

trung tâm ƣa chuộng vì tính tiện dụng và an toàn của nó. Mặc dù hỗ trợ phôi

thoát màng có thể sử dụng rộng rãi cho nhiều trƣờng hợp, nhƣng nói chung,

kỹ thuật này thƣờng đƣợc dùng cho một số chỉ định của bệnh nhân thụ tinh

trong ống nghiệm [38], [156].

Tại Việt Nam, kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser mới đƣợc

áp dụng. Bệnh viện Phụ Sản Trung Ƣơng bắt đầu thực hiện hỗ trợ phôi thoát

màng vào năm 2009. Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu trên thế giới và một

số rất ít nghiên cứu trong nƣớc đánh giá hiệu quả của kỹ thuật hỗ trợ thoát

màng trong TTTON. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng hỗ trợ thoát màng

nói chung giúp làm tăng tỉ lệ phôi làm tổ và tỉ lệ có thai của TTTON [38],

[156]. Bên cạnh đó cũng có không ít nghiên cứu cho thấy kỹ thuật này không

đem lại hiệu quả [38], [141], [163].

Nhìn chung, vẫn tồn tại một số vấn đề mà các nghiên cứu trƣớc đây còn

chƣa đề cập đến hoặc còn chƣa thống nhất. Đó là hỗ trợ phôi thoát màng trên

3

nhóm đối tƣợng TTTON nào sẽ có hiệu quả? Nếu có hiệu quả thì cách thức

đục lỗ hay làm mỏng sẽ tốt hơn? Nếu đục lỗ hay làm mỏng thì kích thƣớc bao

nhiêu là tối ƣu? Để góp phần trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu với Đề tài “ Nghiên cứu kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser

trong một số chỉ định trên bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm”.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia

laser diode 1.48µm với hai phƣơng pháp đục lỗ và làm mỏng màng

trong suốt của phôi ở bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm trên 38

tuổi chuyển phôi tƣơi.

2. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser

diode 1.48µm với hai phƣơng pháp đục lỗ và làm mỏng màng trong

suốt của phôi trên các bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh.

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) [39], [57]

TTTON có nghĩa là cho tinh trùng thụ tinh với noãn và nuôi cấy thành

phôi trong ống nghiệm. Sau đó, một số phôi sẽ đƣợc chuyển trở lại vào buồng

tử cung. Quá trình phát triển của phôi và thai sẽ diễn ra hoàn toàn bình thƣờng

trong tử cung ngƣời mẹ.

Kỹ thuật này đƣợc thực hiện thành công trên thế giới lần đầu tiên vào

năm 1978 và lần đầu tiên ở Việt Nam năm 1998.

Một chu kỳ TTTON bao gồm: kích thích nang noãn, chọc hút lấy noãn

ra ngoài cho kết hợp với tinh trùng trong phòng thí nghiệm, nuôi cấy thành

phôi để chuyển trở lại vào buồng tử cung.

Có 3 phác đồ KTBT thƣờng đƣợc sử dụng: Phác đồ dài (thƣờng dùng

trong IVF cổ điển): dùng GnRH đồng vận (GnRH a) bắt đầu từ ngày thứ nhất

của chu kỳ kinh hoặc từ ngày thứ 21 của chu kỳ và liên tục trong 14 ngày. Sau

đó, dùng FSH phối hợp với GnRH cho đến khi tiêm hCG. Phác đồ ngắn:

GnRHa đƣợc tiêm cùng với FSH từ đầu chu kỳ. Phác đồ ngắn thƣờng đƣợc

chỉ định cho những phụ nữ có dự trữ buồng trứng kém. Có thể sử dụng GnRH

đối vận (GnRH-antagonis) từ ngày 5-6 của chu kỳ để đề phòng đỉnh LH nội

sinh hoặc để giảm nguy cơ quá kích buồng trứng. Từ ngày thứ 8-13 của FSH,

4

chỉ định cho thuốc rụng noãn (thƣờng dùng hCG) khi siêu âm có > 1 nang

18mm hoặc > 3 nang noãn kích thƣớc > 16 mm.

Chọc hút noãn sau tiêm hCG 34-36 giờ. Noãn thu đƣợc sẽ ủ ấm trong

tủ cấy CO2, 370C khoảng 3-6h trƣớc khi đƣợc cấy với tinh trùng hoặc cho thụ

tinh bằng kỹ thuật ICSI.

Đánh giá thụ tinh đƣợc tiến hành 18-20h sau cấy với tinh trùng trong

kỹ thuật IVF cổ điển, 14-16h sau tiêm tinh trùng vào bào tƣơng noãn. Đánh

giá thụ tinh bình thƣờng khi thấy hai tiền nhân.

Hiện nay, các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới đánh giá chất

lƣợng phôi chủ yếu dựa vào hình thái và tốc độ phân chia của phôi. Hình thái

của phôi đƣợc theo dõi và đánh giá từ hình thái noãn, hợp tử rồi đến phôi

phân chia. Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm (ngày 2, 3) dựa

vào các chỉ tiêu chính là số lƣợng phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào, tỷ

lệ các mảnh vỡ (fragment). Các chỉ tiêu phụ gồm có sự phân chia phôi bào

đồng thời (synchronise - phân chia 2-4-8), mật độ hạt trong bào tƣơng, số

lƣợng hạt nhân, không bào trong phôi bào. Đánh giá hình thái phôi nang dựa

vào độ nở rộng của phôi, hình thái của khối tế bào nội phôi (ICM) và nguyên

bào lá nuôi (TE).

Hình 1.1. Quy trình thụ tinh ống nghiệm.

(Nguồn http://www.kjivf.com/ivf.php).

Các phôi tốt nhất sẽ đƣợc chọn để chuyển phôi. Hiện nay đa số các

trung tâm lớn ở Mỹ và Châu Âu thƣờng chuyển 1-2 phôi ngày 5 (phôi nang).

Hai tuần sau khi chuyển phôi, ngƣời phụ nữ đƣợc lấy máu để thử thai.

Nếu kết quả thử thai dƣơng tính (hCG > 50 IU/l), 2-3 tuần sau, sản phụ sẽ

đƣợc siêu âm để xác định túi ối và tim thai trong buồng tử cung.

Chọc hút noãn qua âm đạo

Nuôi cấy phôi

Chuyển phôi

Kích thích nang noãn

5

Tỉ lệ thành công của mỗi chu kỳ điều trị TTTON trung bình trên thế

giới hiện nay khoảng 25%-70%. Tỉ lệ này phụ thuộc vào tuổi bệnh nhân, chỉ

định điều trị và phác đồ điều trị của từng trung tâm.

1.2. Một số kỹ thuật hỗ trợ sinh sản thông dụng kèm theo TTTON

1.2.1. Đông lạnh phôi

Đây là kỹ thuật phổ biến ở hầu hết các trung tâm làm thụ tinh trong ống

nghiệm. Nguồn phôi đông lạnh chủ yếu từ các phôi thừa sau chu kỳ chuyển

phôi tƣơi, hoặc từ phôi của các bệnh nhân vì một số lý do không chuyển đƣợc

phôi tƣơi hay từ phôi của ngƣời hiến tặng. Phôi có thể đƣợc đông lạnh ở các

giai đoạn phát triển khác nhau của phôi và bằng các phƣơng pháp đông lạnh

khác nhau nhƣ đông lạnh chậm, đông phôi thuỷ tinh hoá. Trong đó, phƣơng

pháp đông phôi thủy tinh hóa là phổ biến nhất hiện nay.

1.2.2. Đông tinh trùng

Kỹ thuật này đƣợc chỉ định cho các trƣờng hợp chồng khó lấy tinh

trùng hoặc trƣớc khi đi xa hay điều trị tia xạ, hoá chất. Tuy nhiên, cần phân

tích chất lƣợng tinh trùng trƣớc đông để khi rã đông sẽ có những chỉ định

thích hợp cho mẫu tinh trùng đó.

1.2.3. Đông noãn

Đông noãn thƣờng đƣợc chỉ định cho các trƣờng hợp: Chồng không lấy

đƣợc tinh trùng trong ngày vợ chọc hút noãn mà không muốn xin tinh trùng

của ngƣời khác; Các trƣờng hợp xin noãn mà chƣa chuẩn bị niêm mạc tử cung

phù hợp; trƣớc khi điều trị tia xạ, hoá chất; Bảo tồn khả năng sinh sản.

Noãn sau khi rã đông muốn thụ tinh đƣợc phải làm ICSI để khắc phục

khả năng thụ tinh thấp do thay đổi cấu trúc màng trong suốt khi đông lạnh. Tỷ

lệ thai lâm sàng từ các chu kỳ đông noãn còn thấp.

1.2.4. Xin, cho phôi, noãn, tinh trùng

Có nhiều trƣờng hợp không có tinh trùng hoặc không có noãn, do vậy

cần phải dùng noãn hoặc tinh trùng của ngƣời cho. Một số trƣờng hợp không

có phôi của chính mình mà muốn có con có thể xin phôi hiến.

1.2.5. Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

ICSI (intra-cytoplasmic sperm injection) là kỹ thuật dùng hệ thống vi

thao tác xử lý tiêm tinh trùng vào bào tƣơng noãn. Kỹ thuật này giúp kiểm

soát đƣợc tỷ lệ thụ tinh, đảm bảo khả năng có phôi. Do vậy, ICSI góp phần

trong sự ổn định và gia tăng hiệu quả của một chu kỳ TTTON.

1.2.6. Kỹ thuật lấy tinh trùng từ tinh hoàn và mào tinh

Các kỹ thuật này thực hiện cho các bệnh nhân vô sinh nam xuất tinh

không có tinh trùng (azoospermia) do tắc hoặc không tắc ống dẫn tinh. Tinh

6

trùng thu đƣợc chƣa trƣởng thành hoàn toàn, do vậy phải tiến hành ICSI để

thụ tinh với noãn.

1.2.7. Hỗ trợ phôi thoát màng (AH)

Kỹ thuật này giúp phôi dễ thoát màng nhằm tăng tỷ lệ có thai và làm tổ

của phôi. Đến nay, trên thế giới đã có 4 phƣơng pháp đƣợc áp dụng để hỗ trợ

phôi thoát màng: Làm mỏng hoặc làm thủng màng trong suốt bằng cơ học,

bằng men pronase, bằng axit Tyrode và bằng tia laser. Có nhiều tranh cãi

xung quanh chỉ định của kỹ thuật cho đối tƣợng TTTON nào thì hiệu quả.

1.2.8. Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD)

Chẩn đoán di truyền trƣớc làm tổ đƣợc tiến hành nhằm sàng lọc phôi

không có bất thƣờng về di truyền trƣớc khi chuyển phôi, đôi khi có thể thực

hiện trên noãn trƣớc khi cho thụ tinh. Kỹ thuật này cho phép các cặp vợ

chồng có nguy cơ truyền bệnh di truyền cho con có cơ hội sinh con không

mắc bệnh, không phải bỏ thai khi thai đã lớn, tránh đƣợc những hậu quả xấu

ảnh hƣởng lên tâm lý của ngƣời mẹ và gia đình.

1.2.9. Nuôi cấy noãn non (IVM)

Trƣởng thành noãn non là kỹ thuật nuôi noãn non đến giai đoạn trƣởng

thành ở môi trƣờng nuôi cấy chuyên biệt ngoài cơ thể. Noãn sau khi đã trƣởng

thành sẽ đƣợc thụ tinh bằng phƣơng pháp IVF/ICSI và nuôi cấy tiếp nhƣ các

trƣờng hợp TTTON thông thƣờng.

1.3. Quá trình phát triển của phôi tiền làm tổ

1.3.1. Quá trình phát triển của phôi tiền làm tổ tự nhiên

Thụ thai là kết quả của quá trình làm tổ của noãn đã thụ tinh. Noãn thụ

tinh hay còn gọi là phôi tiền nhân (phôi ngày 1) sẽ trải qua ba giai đoạn trong

suốt quá trình làm tổ:

* Giai đoạn 1: Di chuyển đến buồng tử cung

- Các yếu tố tác động đến quá trình di chuyển là dịch ổ bụng, hoạt động

cơ trơn của vòi tử cung và hoạt động của nhung mao vòi tử cung.

- Ngoài ra, noãn cũng sẽ thực hiện tuần tự quá trình phân bào và biệt hoá

tế bào trong suốt quá trình di chuyển này:

+ Ngày 0: Noãn thụ tinh với tinh trùng, hiện tƣợng này thƣờng xảy ra ở

một phần ba ngoài của vòi tử cung.

+ Ngày 1: Phôi ngày 1 (hợp tử có hai tiền nhân) trong suốt quá trình di

chuyển đƣợc bảo vệ bởi màng trong suốt (zona pellucida) và đƣợc dinh dƣỡng

nhờ cơ chế thẩm thấu.

+ Ngày 2: Phôi phân chia có từ 2-4 tế bào.

7

+ Ngày 3: Phôi phân chia có từ 6-8 tế bào, lúc này phôi nằm ở khoảng eo

của vòi tử cung.

+ Ngày 4: Phôi tiếp tục phân bào và trở thành phôi dâu, có từ 15-50 tế

bào. Phôi nằm ở đoạn kẽ vòi tử cung.

+ Ngày 5: Hình thành phôi nang (blastocyst), biệt hoá thành hai nhóm tế bào

phôi (nguyên bào lá nuôi và khối tế bào nội phôi). Phôi đã đến buồng tử cung.

+ Ngày 6 (hatching): Phôi thoát khỏi màng trong suốt.

* Giai đoạn 2: Tƣơng tác giữa các nguyên bào lá nuôi của phôi nang và

niêm mạc tử cung và thƣơng lƣợng miễn nhiễm để niêm mạc tử cung chấp

nhận phôi làm tổ.

* Giai đoạn 3: Làm tổ tại niêm mạc tử cung.

+ Ngày 8: Phôi thoát màng chìm vào niêm mạc tử cung, hình thành phôi

hai lá, chƣa tiếp xúc với mạch máu của mẹ.

+ Ngày 9: Phôi chìm hoàn toàn vào niêm mạc tử cung, tạo các hốc giữa

các hợp bào nuôi, chƣa tiếp xúc với mạch máu mẹ.

+ Ngày 10: Tiếp xúc với mạch máu mẹ nên hiện diện hCG trong máu mẹ.

1.3.2. Quá trình phát triển của phôi tiền làm tổ trong TTTON

+ Ngày 0: Noãn sau chọc hút đƣợc các chuyên viên phôi học thu nhặt

và đánh giá chất lƣợng noãn dựa vào hình thái trƣởng thành của các tế bào hạt

bao quanh noãn, bào tƣơng noãn, cực cầu và nhân của noãn. Cho noãn thụ

tinh với tinh trùng sau chọc hút 3- 6h.

+ Ngày 1: Kiểm tra thụ tinh. Hình thái hai tiền nhân có thể tiên lƣợng

đƣợc khả năng phát triển của phôi [140], [154], [155]. Đánh giá hình thái dựa

vào kích cỡ, vị trí hai tiền nhân và các hạt nhân.

+ Ngày 2, 3: Giai đoạn phôi phân chia sớm: Đánh giá chất lƣợng phôi

dựa vào hình thái: số lƣợng (ngày 2: 4 tế bào; ngày 3: 8 tế bào) và độ đồng

đều của phôi bào, sự phân chia đồng bộ (2-4-8) của phôi bào, độ chiết quang,

mật độ hạt của bào tƣơng phôi bào,... Đánh giá chất lƣợng phôi ngày 2 rất

quan trọng để quyết định ngày chuyển phôi. Có thể chuyển phôi ngày 2, ngày

3 hoặc ngày 5 (tùy trung tâm). Thông thƣờng, nếu có ít nhất 2-3 phôi ngày 3

chất lƣợng tốt thì sẽ nuôi cấy tiếp để chuyển phôi ngày 5.

+ Ngày 4: Phôi dâu, bắt đầu xuất hiện các hốc dịch nhỏ.

+ Ngày 5: Phôi nang nở rộng, dịch nang lấp đầy thể tích phôi, khối tế

bào nội phôi có nhiều tế bào nhỏ, liên kết chặt, các nguyên bào lá nuôi có

nhiều tế bào, liên tục.

+ Ngày 6: Phôi thoát màng.

8

Kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng đƣợc thực hiện trên phôi ngày 2, ngày

3 hoặc ngày 5 (tùy trung tâm). Khi tiến hành AH trên phôi ngày 2, ngày 3,

thƣờng đến ngày 5 phôi sẽ thoát màng (sớm hơn tự nhiên một ngày), giúp cho

phôi làm tổ sớm hơn, dễ đồng bộ với niêm mạc tử cung hơn [100].

1.4. Hỗ trợ phôi thoát màng

1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thoát màng của phôi

- Màng trong suốt

Một trong các yếu tố chính quyết định khả năng thoát màng của phôi là

màng trong suốt. Phôi thoát màng đƣợc hay không còn phụ thuộc vào độ dày

màng trong suốt và tính đàn hồi của màng này. Ở ngƣời, màng trong suốt dày

khoảng 13-15 m. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy màng trong suốt của

các đối tƣợng bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm có độ dày trung bình vào

khoảng 16-19 m [16], [72], [112], [118], [124]. Màng trong suốt có bản chất

glycoprotein và có nhiều chức năng quan trọng. Cấu trúc màng trong suốt

ngƣời gồm bốn loại glycoprotein (ZP1, ZP2, ZP3, ZPB) [92]. Ngƣời ta xác

định đƣợc ba gen mã hóa các loại protein này [143]. Ở một số loài protein tổng

hợp nên màng trong suốt đƣợc sản xuất tại gan, trong khi ở động vật có vú,

protein đó đƣợc sản xuất ngay tại buồng trứng [94]. Các protein này đƣợc hoạt

tiết trong quá trình nang noãn phát triển để hình thành màng trong suốt [64],

[143]. Nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhƣng cấu trúc của màng trong suốt

noãn và phôi ngƣời cho đến nay vẫn chƣa đƣợc biết rõ. Các mô hình cấu trúc

hiện nay đƣợc xây dựng dựa trên phân tích màng trong suốt của động vật có

vú. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy màng trong suốt là màng kép có ba lớp

đồng tâm [36], [174]. Các sợi của lớp trong cùng (lớp 1) tỏa tròn hình vành tia.

Các sợi của lớp ngoài cùng (lớp 3) xếp theo hƣớng tiếp tuyến. Các sợi lớp giữa

xếp ngẫu nhiên. Dƣới kính hiển vi (KHV) phân cực, các lớp này lƣỡng chiết,

phân biệt rõ 3 lớp với lớp giữa chiết quang ít nhất (hình 1.2) [36].

9

Hình 1.2. Cấu trúc nhiều lớp của màng trong suốt chụp dưới KHV phân cực

(PolScope). A: noãn người chụp KHV đảo ngược bình thường. B: noãn người chụp

KHV phân cực. C: Phôi ngày 3 chụp phân cực. D: Các lớp của màng trong suốt phân

biệt dưới KHV phân cực. E: Các lớp của màng trong suốt noãn và phôi.

(Nguồn: Pelletier. PolScope views laminar zona. Fertil Steril 2004 [36]).

Trong nang noãn, màng trong suốt đóng vai trò nhƣ một hàng rào sinh

lý ngăn giữa noãn và các tế bào nang. Khi thụ tinh, tinh trùng gắn với các thụ

thể trên bề mặt màng trong suốt. Những thay đổi về sinh hoá của màng trong

suốt xảy ra sau khi thụ tinh làm màng này cứng lại và ngăn chặn hiện tƣợng

đa thụ tinh [44]. Trong quá trình phát triển của phôi giai đoạn tiền làm tổ,

màng trong suốt bảo vệ sự toàn vẹn của phôi [17]. Khi di chuyển từ vòi trứng

về tử cung, màng trong suốt rất cần thiết để đảm bảo cấu trúc của phôi vì liên

kết giữa các tế bào của phôi rất yếu. Ngoài ra, nếu tách bỏ toàn bộ hoặc một

phần màng trong suốt của phôi cừu thì phôi có thể bị thoái hoá khi gặp một số

kháng thể trong tử cung [158]. Khi làm thụ tinh trong ống nghiệm, màng

trong suốt của phôi có thể bị cứng lại do ảnh hƣởng của quá trình nuôi cấy

kéo dài hoặc phải trải qua đông lạnh và rã đông... [33], [41].

Bên cạnh đó, màng trong suốt còn có thể chịu ảnh hƣởng của một số

yếu tố khác. Môi trƣờng nội tiết do dùng thuốc kích thích rụng trứng cũng là

một yếu tố liên quan đến độ dày màng trong suốt [23].

Đã có những nghiên cứu cho thấy độ dày và hình dạng của màng trong

suốt có liên quan đến chất lƣợng phôi, sự phát triển của phôi và tỷ lệ có thai

[58], [78]. Đặc biệt là quá trình mỏng đi của màng trong khi phôi phát triển.

Trong tự nhiên, khi phôi ngày 5 (phôi nang-blastocyst), di chuyển đến tử

cung, phôi sẽ tự thoát màng và hiện tƣợng làm tổ sẽ xảy ra. Trƣớc khi thoát

màng, phôi nang nở to, màng trong suốt giãn ra và mỏng đi. Trong quá trình

Noãn Phôi

Lớp3

Lớp 2

Lớp 1

Mặt trong màng trong suốt

Mặt ngoài màng trong suốt

Thoi vô sắc

Màng trong suốt

Thƣớc đo 20µm

10

thoát màng, màng trong suốt mỏng đi do hai yếu tố: (1) Xuất hiện các chu kỳ

co thắt và dãn ra của phôi; (2) Vai trò của chất lysins do các nguyên bào lá

nuôi và niêm mạc tử cung tiết ra làm ly giải màng trong suốt. Khi không có

chất này sẽ dẫn tới việc làm tổ thất bại [62]. Chu kỳ co giãn của màng trong

suốt đƣợc theo dõi trên thực nghiệm ở phôi nang của chuột, cừu, bò và ngƣời.

Kết quả là sau vài chu kỳ nhƣ vậy, màng trong suốt sẽ mỏng đi. Tƣơng tự nhƣ

vậy, chu kỳ co giãn xảy ra trên các nguyên bào lá nuôi của phôi nang ngƣời,

hiện tƣợng này cũng giúp cho phôi thoát màng xảy ra trong điều kiện nuôi

cấy. Tuy vậy, ở điều kiện tự nhiên, chƣa rõ sự co giãn này có làm phôi thoát

màng tốt hơn hay không, nhƣng dƣờng nhƣ nó cũng giúp cho phôi tiếp xúc và

làm tổ trên niêm mạc tử cung [63].

Ngƣời ta nhận thấy rằng quá trình mỏng đi này không chỉ thƣờng thấy rõ

ở giai đoạn phôi nang nở ra, mà còn thấy đƣợc từ giai đoạn hợp tử cũng nhƣ

giai đoạn phân chia của phôi. Những phôi tốt nhất thƣờng có sự thay đổi độ

dày mỏng của màng trong suốt. Theo Gabrielsen và cộng sự (2000), khi màng

trong suốt mỏng đi hơn 25%, tỷ lệ có thai là 40% (24/60). Ngƣợc lại, với

những phôi có màng mỏng đi ít hơn 10% thì không ghi nhận đƣợc trƣờng hợp

nào có thai (0/21). Ngoài ra, sự mỏng đi của màng trong suốt không những liên

quan đến tỷ lệ có thai cao mà còn liên quan đến hình thái phôi tốt [55], [56].

- Men lysins

Nghiên cứu của Schiewe và cộng sự (1995) trên chuột cho thấy, cơ chế

khởi phát của sự làm tổ dƣờng nhƣ không phải do lysins của màng trong suốt

và các chu kỳ co giãn của phôi nang. Các tác giả cho rằng lá nuôi của phôi

(TE) chịu trách nhiệm chế tiết lysins cần thiết cho sự làm tổ [135].

- Sự phát triển của phôi

Các số liệu nghiên cứu trên phôi nang chuột gần đây cho thấy phôi thoát

màng khi nuôi cấy nhân tạo phụ thuộc vào số lƣợng tế bào đầy đủ để cấu thành

phôi đó. Đối với các phôi ngừng phát triển (có thể do nhiều yếu tố: Chất lƣợng

noãn, chất lƣợng tinh trùng, chất lƣợng phôi không tốt do các nguyên nhân di

truyền, do phác đồ KTBT... hoặc do các yếu tố khách quan: môi trƣờng nuôi

cấy, chất lƣợng lab thụ tinh ống nghiệm không đảm bảo...), hiện tƣợng thoát

màng không thể xảy ra. Phôi không có đủ số lƣợng tế bào, áp lực nội phôi

không đủ làm cho phôi không nở ra đƣợc để thoát màng [trích dẫn 39, 76].

- Một số yếu tố khác

Phôi thoát màng trong tự nhiên không giống nhƣ phôi nuôi cấy. Phôi

nuôi cấy (in vitro) thƣờng tự thoát màng chậm hơn so với phôi tự nhiên (in

vivo) khoảng 1-2 ngày [62]. Sự khác biệt này liên quan đến tử cung và các

yếu tố gây ly giải lá nuôi phôi (TE) của niêm mạc tử cung [88].

1.4.2. Hỗ trợ phôi thoát màng: khái niệm, chỉ định, các phương pháp

11

1.4.2.1. Khái niệm

Dựa trên giả thuyết về sự bất thƣờng có thể có của màng trong suốt và

sự thoát màng của phôi trong khi thực hiện nuôi cấy phôi trong TTTON, các

nhà khoa học phát triển các kỹ thuật làm mỏng hoặc làm thủng màng trong

suốt bên ngoài phôi, giúp phôi dễ thoát ra ngoài và làm tổ vào tử cung hơn.

Kỹ thuật này đƣợc các tác giả đặt tên là kỹ thuật ―hỗ trợ phôi thoát màng‖

(assisted hatching) [33].

Hỗ trợ thoát màng có thể đƣợc thực hiện từ các phôi ở giai đoạn phân

chia sớm đến giai đoạn phôi nang, bằng các phƣơng pháp khác nhau và trên

nhiều chỉ định khác nhau của bệnh nhân TTTON.

1.4.2.2. Các chỉ định thường gặp của AH trên bệnh nhân TTTON.

Chỉ định AH đến nay nhìn chung chƣa thống nhất giữa các trung tâm

TTTON, có trung tâm chỉ định AH 100% bệnh nhân TTTON. Ngƣợc lại, có

trung tâm không chỉ định AH vì cho rằng AH không hiệu quả.

Một số chỉ định thƣờng gặp của AH:

1. Bệnh nhân tiên lƣợng kém (ít phôi, lớn tuổi, tăng FSH, màng trong suốt

dày bất thƣờng).

2. Bệnh nhân thất bại nhiều lần mặc dù chất lƣợng phôi tốt.

3. Bệnh nhân chuyển phôi đông lạnh.

Ngoài ra, AH có thể chỉ định trong các trƣờng hợp nuôi noãn non (IVM),

hỗ trợ sinh thiết phôi chẩn đoán di truyền trƣớc làm tổ (PGD), màng trong

suốt của phôi không đàn hồi...

1.4.2.3. Các phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng [39]

Các phƣơng pháp đều có mục đích chung là làm thủng (hình 1.3) hoặc

làm mỏng (hình 1.4) màng trong suốt bao quanh phôi trƣớc khi chuyển phôi vào

tử cung. Cách thức hỗ trợ phôi thoát màng có thể chỉ là đục một lỗ nhỏ hay làm

mỏng 5-10µm hoặc đục lỗ to hay làm mỏng đến nửa chu vi màng trong suốt,

hoặc thậm chí lột bỏ màng trong suốt hay

làm mỏng hoàn toàn màng này.

Hình 1.3. Đục lỗ thủng trên phôi ngày 3.

Màng trong suốt

Lỗ thủng sau AH

12

Hình 1.4. Làm mỏng màng trong suốt của phôi ngày 3.

a. Hỗ trợ phôi thoát màng bằng phương pháp cơ học

Phƣơng pháp cổ điển nhất là phƣơng pháp cơ học. Ngƣời ta sử dụng một kim

giữ phôi và một loại kim chuyên dụng xuyên thủng màng trong suốt, sau đó mài

màng trong suốt vào kim giữ để xé rách một đoạn nhỏ trên màng trong suốt của phôi

(hình 1.5). Cohen và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật xẻ màng trong suốt bán phần

(1989). Niset và cộng sự dùng kỹ thuật mài màng trong suốt (1992) [trích dẫn 39].

Phƣơng pháp này hiện ít đƣợc sử dụng vì khó thao tác, dễ gây tổn thƣơng phôi.

Hình 1.5. Làm mỏng bằng phương pháp cơ học: mài màng trong suốt

b. Hỗ trợ phôi thoát màng bằng men pronase

Trong phƣơng pháp này, phôi sẽ đƣợc cho vào môi trƣờng có chứa men

pronase là một loại men tiêu protein ở nồng độ thích hợp trong một thời gian

ngắn (khoảng 10 giây). Dƣới tác động của men này, toàn bộ màng trong suốt

của phôi sẽ mỏng đi hay hoàn toàn biến mất. Fong và cộng sự (1998) là

những ngƣời đầu tiên báo cáo thành công phƣơng pháp này [51]. Phƣơng

pháp này hiện ít đƣợc sử dụng vì độ an toàn không cao.

c. Hỗ trợ phôi thoát màng bằng axit Tyrode

Phƣơng pháp hỗ trợ thoát màng sau phƣơng pháp cơ học thƣờng đƣợc

dùng là phƣơng pháp sử dụng axit Tyrode. Điểm yếu của phƣơng pháp này là

axit Tyrode có tính độc trên phôi, làm tiêu các phôi bào, ngoài ra còn đòi hỏi

kỹ năng thao tác chuẩn xác, hạn chế tối đa thời gian phôi tiếp xúc với axit.

Lợi thế khi dùng axit Tyrode so với phƣơng pháp cơ học là có thể tăng kích

Phôi bào

Vị trí làm mỏng

13

thƣớc lỗ thủng trên màng trong suốt dễ dàng hơn. Ngoài ra, không cần phải

đầu tƣ ban đầu tốn kém cho phƣơng pháp này. Tuy nhiên, mỗi lần thao tác lại

tốn khá nhiều dụng cụ tiêu hao.

Hình 1.6. Làm mỏng màng trong suốt bằng

axit Tyrode.

Kỹ thuật này cần dùng một kim giữ (holding pipette) để giữ phôi và một

kim chuyên dụng (hatching pipette hay micropipette) để bơm dung dịch axit

(hình 1.6). Sau khi làm mỏng hoặc tạo lỗ đạt yêu cầu cần dừng ngay bơm axit ra

tiếp để tránh cho khoang quanh phôi khỏi bị axit xâm nhập và rửa sạch phôi khỏi

môi trƣờng có axit. Ngƣời ta có thể hút bớt một số mảnh vỡ ngoài các phôi bào,

hoặc các phôi bào thoái hoá của phôi rã đông trong quá trình này [127].

d. Hỗ trợ phôi thoát màng bằng tia laser (LAH)

Đây là phƣơng pháp ra đời sau cùng và đƣợc xem là tiên tiến nhất hiện nay.

Tadir và cộng sự (1991) là những ngƣời đầu tiên mô tả phƣơng pháp này [151].

* Khái niệm laser [7]

Laser là chữ viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Light Amplification by

Stimulated Emission of Radiation, nghĩa là: khuếch đại ánh sáng bằng bức xạ

cƣỡng bức. Laser là chùm ánh sáng có những tính chất đặc biệt: Có độ đơn

sắc, độ định hƣớng và độ chói phổ rất cao. Những tính chất trên tạo ra một ƣu

thế đặc biệt của laser và đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau.

14

* Các loại tia laser và ứng dụng

Nguồn laser sử dụng trong y học gồm hai nhóm chính [5]:

- Các laser công suất thấp, còn gọi là laser mềm hay laser không nhiệt,

đƣợc sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực Vật lý trị liệu để điều trị bệnh. Các chùm

tia laser này có công suất chỉ cỡ vài milliwatt tới vài chục milliwatt và chỉ gây

tǎng nhiệt độ của tổ chức đƣợc chiếu không quá 0,10C-0,50C. Hiệu quả điều

trị của laser loại này dựa trên sự kích thích sinh học của tia laser dẫn tới điều

chỉnh lại các rối loạn hoạt động của tổ chức bị tổn thƣơng, tǎng cƣờng sức đề

kháng và tái tạo mô. Điển hình cho nhóm laser này là: Laser He-Ne, laser IR

(laser bán dẫn hồng ngoại: Ga-As), laser He-Cd và laser Nitơ...

- Các laser công suất cao, còn gọi là laser cứng. Chùm tia laser loại này

thƣờng phải có công suất lớn cỡ vài watt cho tới vài trǎm watt. Các laser này

tạo ra hiệu ứng nhiệt để làm quang đông hoặc bốc bay tổ chức. Điển hình cho

nhóm này là: Laser CO2, laser Nd-YAG, laser Rubi, laser Argon,...Laser

diode bán dẫn cũng nằm trong nhóm này.

* Các loại tia laser dùng trong hỗ trợ phôi thoát màng(LAH)

Có hai loại LAH:

(1) Laser tiếp xúc: Xung laser đƣợc truyền qua sợi quang siêu vi tiếp xúc

trực tiếp với màng trong suốt bằng một kim chuyên dụng. Sau đó, nhiều tác

giả khác sử dụng tia laser trực tiếp nhƣng có cải tiến hơn. Nhƣợc điểm của

dùng tia laser trực tiếp là năng lƣợng laser theo dõi khó chính xác, có thể tạo

các xung laser không an toàn. Ngoài ra, hệ thống này mở nên dễ bị bụi bẩn,

tắc nghẽn đầu dây, khó tinh chỉnh, dễ bị ảnh hƣởng của môi trƣờng ngoài.

(2) Laser không tiếp xúc: Hệ thống laser không tiếp xúc cho phép vật kính

truyền ánh sáng của tia laser đến đƣợc đích. Tia laser đƣợc truyền qua nƣớc,

do vậy tránh cho tia làm đột biến phôi. Blanchet và cộng sự là những ngƣời

đầu tiên sử dụng hệ thống này [26]. Hiện nay, hệ thống này đƣợc tinh chỉnh

về độ an toàn rất tốt và hiệu quả cao để sử dụng cho phôi ngƣời. Khi có hệ

thống này, những ngƣời làm kỹ thuật có thể thực hiện sinh thiết phôi để lấy tế

bào làm chẩn đoán trƣớc sinh dễ dàng hơn, ít gây tổn thƣơng phôi hơn.

Hình 1.7. AH bằng tia laser tiếp xúc