Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học các Stetoid phân cực từ loài sao biển Archaster Typicus Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

TRỊNH THỊ THU HƯƠNG

“NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CÁC STEROID PHÂN CỰC TỪ LOÀI SAO BIỂN

ARCHASTER TYPICUS VIỆT NAM”

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2014

1

MỞ ĐẦU

Biển và Đại dương chiếm hơn 70% bề mặt trái đất, chứa đựng nguồn tài

nguyên sinh vật biển đa dạng với gần 300.000 loài thực vật, động vật và vi sinh vật

khác nhau...Sự đa dạng này đã biến biển và đại dương trở thành nguồn tài nguyên

thiên nhiên vô cùng quý báu, cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp

thiết yếu như thực phẩm, mỹ phẩm, hóa dược…Tuy nhiên, trước đây, giá trị cung

cấp dược liệu và các chất có hoạt tính sinh học cao cho ngành hóa dược của nguồn

tài nguyên này còn chưa được quan tâm đúng mức. Ngày này, nhờ sự hỗ trợ của các

kỹ thuật tiên tiến, rất nhiều hợp chất từ sinh vật biển đã được phân lập, xác định cấu

trúc và thử hoạt tính sinh học. Trong số đó, nhiều hợp chất thể hiện các hoạt tính

sinh học phong phú, có thể tạo ra hoặc cung cấp mẫu hình cho các thế hệ thuốc mới,

cũng như các sản phẩm khác phục vụ cho cuộc sống [1-3].

Việt Nam được thiên nhiên ưu đãi với hơn 1 triệu km2

vùng biển, có khí hậu

nhiệt đới gió mùa, mật độ cửa sông dày đặc là những điều kiện lý tưởng cho hệ sinh

vật biển đa dạng về chủng loại và giàu về trữ lượng. Ngay từ những năm 1970 đã có

một vài công trình nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển. Tuy

nhiên, so với nguồn tiềm năng sinh vật biển ở nước ta thì đến nay những công trình

nghiên cứu trong nước vẫn quá ít và tản mát, đặc biệt là những nghiên cứu về ngành

Da Gai.

Các sinh vật thuộc ngành Da Gai (Echinoderm) bao gồm năm lớp: Sao Biển

(Asteroidea), Sao Biển Rắn (Ophiuroidea), Cầu Gai (Echinoidea), Hải Sâm

(Holothuria) và Huệ Biển (Crinoidea), là một trong những nguồn cung cấp dồi dào

các steroid phân cực. Các hợp chất steroid phân cực này có cấu trúc rất đa dạng và

thể hiện nhiều hoạt tính sinh học thú vị khác nhau như: kháng vi khuẩn, kháng nấm,

kháng viêm, giảm đau, giảm huyết áp, chống khối u, chống vi rút, tan máu, tác động

đến sự vận chuyển tín hiệu thần kinh...[8, 11, 22, 26, 27, 69, 77, 107]. Lớp chất

2

steroid phân cực từ sao biển đã và đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học

Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Italia. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có

công trình nào nghiên cứu riêng về lớp chất này.

Với mục đích tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển

thuộc ngành Da gai nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực

phát hiện và phát triển dược phẩm mới, luận án này tập trung nghiên cứu nhóm chất

steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus, một loài sao biển rất phổ biển ở

vùng biển Việt Nam, thuộc lớp sao biển Asterodea, ngành Da gai Echinodermata.

Nội dung của luận án bao gồm:

• Phân lập các hơp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster

typicus của Việt Nam.

• Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.

• Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất phân lập được.

3

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về sao biển (Asteroidea)

Sao biển là loài động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai

(Echinodermata, lớp Asteroidea) sống ở đáy biển. Cơ thể dẹp theo chiều lưng bụng,

có hình sao và có đối xứng bậc 5 hay nhiều cánh xếp xung quanh. Cánh sao biển dài

1- 1,5 cm, có khi tới 80 cm. Lỗ miệng có màu sặc sỡ, khi bò trên giá thì miệng

hướng về phía dưới. Bên trong quanh miệng là vòng ống nước, từ đó phát ra năm

ống nước nhánh hình nan quạt tỏa ra năm cánh, mỗi ống nước nhánh có hai dãy

chân ống. Sao biển đi được nhờ hoạt động của các chân ống một cách nhịp nhàng,

tốc độ di chuyển rất chậm từ 5 đến 10 cm trong 1 phút [2].

Lớp Asteroidea được chia thành 7 bộ (order): Brisingida, Forcipulatida,

Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida. Đến nay đã thống kê

được có có khoảng 1800 loài sao biển phân bố ở tất cả các đại dương trên thế giới.

Những nơi có nhiều sao biển phải kể đến các vùng biển Ôxtrâylia, Đông Thái Bình

Dương và Bắc Mỹ, đặc biệt vùng biển nhiệt đới Ấn Độ-Thái Bình Dương là nơi tập

trung đại đa số các loài sao biển [2, 6]. Ở Việt Nam có khoảng 60 loài sao biển khác

nhau, phân bố dọc bờ biển từ Bắc đến Nam.

Theo tác giả Lamarck (1816) loài sao biển Archaster typicus thuộc họ

Archasteridea trong bộ Valvatida. Bộ Valvatida bao gồm 14 họ: Acanthasteridea,

Archasteridae, Asterinidae, Asterodiscididae, Chaetasteridae, Ganeriidae,

Leilasteridae, Goniasteridae, Mithrodidae, Odontasteridae, Ophidiasteridae,

Oreasteridae, Poraniidae, Pseudarchasteridae, với hàng trăm loài khác nhau.

Trong số đó, Archasteridea là một họ nhỏ với duy nhất một chi ArchasterTM

gồm 3

loài: Archaster angulatus, Archaster laevis và Archaster typicus.

Cho đến nay, trên thế giới đã có khoảng 80 loài sao biển khác nhau được

nghiên cứu về thành phần hóa học [14, 33, 40, 51, 77, 80]. Một số loài được quan

tâm nghiên cứu như Asterina pectinifera [26, 104, 115], Linckia laevigata [14, 24,

25, 36, 37, 43, 46, 48, 86, 87, 114]. Trong số hơn 200 hợp chất thu được có đến trên

4

50% các chất thuộc lớp chất steroid, trên 20% là các ceramide. Ngoài ra, sao biển

còn chứa một số hợp chất khác như: ancaloit, axit béo…Qua đó cho thấy, steroid và

ceramide là những lớp chất chính có trong thành phần hóa học của Sao biển. Các

hợp chất ceramide có đường (cerebroside) từ sao biển thường mang hoạt tính gây

độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm...Cho đến nay, vai trò sinh học của các

cereboside vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Người ta cho rằng, những hợp chất này có

thể tham gia vào các quá trình truyền tín hiệu màng tế bào, sinh trưởng và biệt hóa

tế bào, duy trì hình thái và chức năng của tế bào...Về mặt sinh thái học, các

cerebroside từ biển thể hiện khả năng chống hà rất tốt, một loài thường gây rất

nhiều khó khăn cho tàu thuyền và các phương tiện đánh cá [99].

Lớp chất steroid từ sao biển, đặc biệt nhóm steroid phân cực, thu hút được

nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới bởi những hoạt

tính thú vị của chúng, như: hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư, chống virut, tan

máu, tăng sinh các tế bào thần kinh, kháng viêm, giảm đau, hạ huyết áp...Một vài

hợp chất khác lại thể hiện có hoạt tính kháng vi khuẩn gram dương rất tốt. Trong

vài năm trở lại đây, một số lượng lớn các hợp chất thuộc lớp chất này được phân lập

từ các loài sao biển. Các steroid phân cực thường được chia làm 4 loại: polyhydroxy

steroid, steroid sulfate, glycoside polyhydroxy steroid và các asterosaponine. Trong

đó, các glycoside polyhydroxy steroid và các asterosaponine thường thấy ở các loài

thuộc chi Echinaster và các polyhydroxy steroid được thấy có mặt ở hầu hết các

loài sao biển đã được nghiên cứu [28]. Nghiên cứu về mối tương quan giữa cấu trúc

và hoạt tính chỉ ra rằng, hoạt tính của các steroid có đường phụ thuộc chủ yếu vào

số lượng các tiểu phân đường và cấu tạo của mạch nhánh. Tuy nhiên, sự ảnh hưởng

của cấu trúc các loại đường và phần anglycon đến hoạt tính vẫn chưa được làm sáng

tỏ. Gần đây các nhà khoa học Nga đã tiến hành nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc

của các polyhydroxy steroid với hoạt tính độc tế bào và tan máu. Tám hợp chất từ

bốn loài sao biển khác nhau đã được thử nghiệm hoạt động làm tan hồng cầu chuột

và gây độc giao tử (trứng và tinh trùng) của loài cầu gai Strongylocentrotus

intermedius. Các tác giả đã phát hiện ra rằng, hoạt tính gây độc tế bào của một số

hợp chất tăng tỷ lệ nghịch với số lượng nhóm OH ở phần aglycon. Mặt khác, có mối

5

liên hệ giữa độc tính tế bào và hoạt động làm tan máu của các steroid thử nghiệm.

Nồng độ muối, nhiệt độ và giá trị pH là yếu tố quan trọng quyết định hoạt động làm

tan máu của các steroid gắn đường này. Những nghiên cứu khoa học cũng chỉ ra

rằng những steroid này đóng vai trò là thành phần màng tế bào của các loài sao

biển, có đóng góp cho việc bền hóa màng kép tế bào [28, 95, 104]. Gần đây, mười

hợp chất polyhydroxy steroid, kí hiệu là certonardoside A-J, đã được phân lập từ

loài sao biển Certonadoa semiregularis ở đảo Komun, Hàn Quốc. Các hợp chất này

đều thể hiện phổ kháng virut rộng như HIV, HSV, CoxB, EMCV và VSV, trong số

đó, hai hợp chất certonardoside I và J thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Hợp chất

ganglioside, LMG-4, phân lập từ loài Luidia maculata có hoạt tính gây độc đối với

tế bào PC12 trong sự có mặt của các yếu tố tăng trưởng thần kinh NGF [6]. Ngoài

ra còn có một số hợp chất polyhydroxy steroid gắn đường thể hiện hoạt tính kháng

một số dòng vi khuẩn và hoạt tính gây độc tế bào tương đối tốt.

Bảng 1.1: Tổng hợp hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực

STT Hoạt tính

sinh học

Nhóm chất Sao biển chứa

hợp chất có hoạt

tính

TLTK

Polyhydroxy steroid

steroid sulfate

Glycoside polyhydroxy

steroid

1 Hoạt tính gây

độc tế bào

Asterosaponine

Certonardoa

semiregularis;

Hippasteria

phrygiana; Luidia

quinaria; Anthenea

chinensis

[16], [21],

[62], [79],

[102], [108-

111],

Polyhydroxy steroid

steroid sulfate

Glycoside polyhydroxy

steroid

2 Hoạt tính

kháng khuẩn,

kháng nấm

Asterosaponine

Certonardoa

semiregularis;

Anasterias minuta;

[12], [13],

[110], [111]

3 Hoạt tính tán Polyhydroxy steroid Henricia [33], [40],

6

Glycoside polyhydroxy

steroid

huyết

Asterosaponine

leviuscula; Culcita

novaeguineae

[67], [101]

4 Hoạt tính

neuritogenic

Glycoside polyhydroxy

steroid

Linckia laevigata; [23], [24],

[46], [81],

[85-87]

Những thông tin trên cho thấy khả năng ứng dụng tiềm tàng của sao biển nói

chung và đặc biệt về lớp chất steroid phân cực từ sao biển nói riêng trong công

nghiệp dược phẩm. Các hợp chất này có cấu trúc vô cùng đa dạng và luôn mang

những đặc điểm riêng biệt. Nước ta có nguồn tài nguyên sinh vật biển rất phong

phú, nhưng đến nay chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về hóa học và hoạt

tính sinh học của lớp chất steroid phân cực từ sao biển. Do đó, nhằm tạo cơ sở cho

những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực phát hiện và phát triển dược phẩm mới,

trong luận án này chúng tôi đặt ra mục tiêu nghiên cứu thành phần hóa học và khảo

sát hoạt tính sinh học của lớp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster

typicus sinh sống tại vùng biển Việt Nam.

1.2. Những nghiên cứu trước đây về lớp chất steroid phân cực có trong các

loài sao biển

1.2.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài sao biển cho

thấy, lớp chất chính có trong sao biển là steroid. Dựa vào cấu trúc hóa học của các

steroid phân lập được người ta chia chúng thành các nhóm như sau: polyhydroxy

steroid, steroid sulfate, glycoside polyhydroxy steroid và các asterosaponine [96,

105].

1.2.1.1. Các hợp chất Polyhydroxy steroid

Trước năm 2000 đã có một số công bố về nhóm chất này từ sao biển [90].

Trong vài năm gần đây, khoảng 50 hợp chất polyhydroxy steroid mới đã được phân

lập từ nguồn tài nguyên này.

7

Năm 2003, từ loài sao biển Certonardoa semiregularis thu thập được ở gần

đảo Komun, Hàn Quốc, Wang và cs đã phân lập được 13 hợp chất polyhydroxy

steroid mới là certonardosterol A-M (1-13) [111]. Mạch nhánh của các hợp chất 9,

10 lần đầu tiên được tìm thấy trong các hợp chất sterol thiên nhiên [108, 111]. Cũng

từ loài này, vào năm 2004 nhóm nghiên cứu đã tách được thêm được 23 hợp chất

polyhydroxy steroid mới 14-36. Trong số đó, có năm hợp chất 14,15,19-21 thuộc

nhóm tetrol, là một nhóm chất rất hiếm [107, 108]. Các hợp chất steroid 25-31 có

chứa nhóm xeton tại vị trí C-8 trong khung steroid cũng là cấu trúc rất ít gặp ở sao

biển. Các hợp chất 28-31 ở vị trí C-8/C-14 có chứa một liên kết đôi [108]. Cấu trúc

đặc biệt này cũng được tìm thấy trong một số loài hải miên. Các hợp chất 9, 10, 34

có chứa mạch nhánh rất đặc biệt không chỉ ở sự ankyl hóa hay đề ankyl hóa mà còn

ở vị trí bất thường của các nhóm –OH.

8

Năm 2004, từ loài sao biển Astropecten triseriatus thu thập từ vùng biển FiJi,

nhóm nghiên cứu của Levina EV và cộng sự đã phân lập được một polyhydroxy

steroid liên hết với triseramide 37 [63]. Hợp chất này mới chỉ được tìm thấy trong

một số loài thực vật bậc thấp. Các hợp chất steroid tương tự cũng được nhóm

nghiên cứu Finamore E và cộng sự tìm thấy trong loài sao biển Myxoderma

platyacantum [19].

Từ năm 2002-2005, nhóm nghiên cứu Stonik và cộng sự đã phân lập được một

dãy các hợp chất polyhydroxy steroid từ các mẫu sao biển của vùng Viễn Đông, LB

Nga [60, 66]. Từ hai loài sao biển Henricia sanguinolenta và H.leviuscula đã phân

lập được 2 hợp chất steroid phân cực mới, kí hiệu 38-39 [60, 67]. Trong đó, hợp

chất tetrol 38 có cấu trúc phần nhân 3β,6β,15β-trihydroxy steroid rất hiếm thấy còn

hợp chất 39 có chứa nhóm xeton ở vị trí C-15 giống như các hợp chất 25-31. Từ

loài sao biển Henricia tumida, nhóm nghiên cứu này cũng đã phân lập được 2 hợp

chất polyhydroxy steroid mới, kí hiệu 40-41 [66].

Từ loài sao biển Hippasteria phrigyana đã phân lập được phrygiasterol 42

[62]. Đây là hợp chất polyhydroxy steroid chứa vòng xyclopropan lần đầu tiên được

phân lập từ loài da gai. Nhóm hợp chất này có mối quan hệ với các sterol tự do

được tìm thấy trong Hải miên, San hô cứng và san hô mềm.

Từ dịch chiết MeOH của loài sao biển Henricia leviuscula đã phân lập được 2

polyhydroxy steroid 43-44 có chứa 2 nhóm –OH ở vị trí C23, C24 và C24, C25

của phần mạch nhánh [20, 33, 72, 94].

9

Cũng từ loài sao biển này, gần đây, nhóm nghiên cứu Kicha A.A. và cs đã

phân lập thêm được hợp chất 45. Một hợp chất polyhydroxy steroid khác 46 có

chứa 15,16-isopropylidenedioxy được phân lập từ loài sao biển Asterina pectinifera

ở vùng DaMaDao, Qungdao, Trung Quốc [115]. Tuy nhiên, có thể hợp chất 46 là

sản phẩm của phản ứng với aceton trong quá trình chiết tách.

10

Sự hiện diện một loạt các dẫn xuất polyhydroxy steroid trong các loài sao biển

khác nhau cho thấy sự đa dạng về cấu trúc của nhóm chất này trong lớp Sao biển

Asteroidea cũng như tầm quan trọng của chúng đối với sự tồn tại của sao biển.

1.2.1.2. Các hợp chất steroid sulfate

Năm 2001 từ 2 loài sao biển Leptasterias alaskensis asiatica và L. fisheri thu

thập được ở vùng Viễn Đông, nhóm nghiên cứu người Nga đã phân lập được ba

dẫn xuất cholesterol sulfate [41]. Hợp chất cholesterol sulfate (47) được tìm thấy là

một sterol sulfate chủ yếu trong dịch chiết từ 2 loài sao biển Leptasterias alaskensis

asiatica và L. fisheri với hàm lượng tương ứng là 53,4% và 37,8%, tuy nhiên 5α￾cholestan-3β-ol sulfate (48) (24,3 và 28,2%) và 5α-cholestan-7-ene-3β-ol sulfate

(49) (11,2 and 20,0%) cũng được xem như là thành phần nổi trội của 2 loài sao biển

này.

Từ dịch chiết của loài sao biển Lethasterias nanimensis chelifera đã phân lập

được một cặp ion rất độc đáo có tên là alkaloid steroid bao gồm một cation alkaloid

và một anion steroid đã được phân lập bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo [50].

Cấu trúc của chúng được xác định là 1-methyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-

tetrahydroisoquino-linium salts of asterone sulfate (50), isoasterone sulfate (51) và

tornasterol A sulfate (52). Tiếp tục nghiên cứu về loài sao biển này, nhóm tác giả đã

phân lập được rất nhiều hợp chất sulfate steroid khác (53-58) trong đó có 3 hợp chất

mới là 54, 56, 57 [44]. Các steroid 53-55 được xác định là muối sulfate tương ứng

của các hợp chất asterone sulfate, isoasterone sulfate và tornasterol A sulfate. Các

hợp chất 56-58 được chứng minh là muối tyrammonium của các sulfate steroid

tương ứng.

11

Từ loài sao biển Asterias amurensis rất phổ biến ở Trung Quốc đã phân lập

được nhiều hợp chất muối sulfate đã biết, bao gồm: cholesterol sulfate (47),

asterone sulfate (53), 24,25-dihydromarthasterone sulfate (59) và tornasterol A

sulfate (55), 3β-O-sulfo-6α-hydroxy-cholesta-9(11),20(22)-dien-23-one (60) và 3β￾O-sulfo-6α-hydroxy-ergost-9(11)-en-23-one (61) [69].

Một nhóm khác của monosulfate steroid mới được đặc trưng bởi các hợp chất

polyhydroxy steroid có chứa thêm một nhóm sulfate ở các vị trí khác nhau trong

nhân steroid và trên mạch nhánh cũng được tìm thấy trong nhiều loài sao biển. VD

12

như: Từ loài sao biển Henricia leviuscula đã phân lập được 2 hợp chất mới (62-63)

với nhóm sulfate ở mạch nhánh [33]. Từ 2 loài sao biển Hippasteria phrigyana [58]

và Trofodiscusuber [61] cũng đã phân lập được 2 hợp chất polyhydroxy steroid

mới với nhóm sulfate ở nhân tại các vị trí lần lượt là C6, C15.

Từ loài sao biển Ctenodiscus crispatus ở vùng biển Thái Bình Dương thu được

4 hợp chất polyhydroxy steroid sulfate (62,66-68) có chứa nhóm OH ở vị trí C-26

[51]. Hợp chất 66 là một sulfate hexaol đã biết có cấu hình tuyệt đối tại C-24, C-25

là (24R, 25R), trong khi đó hợp chất 67 là đồng phân quang học của hợp chất 66 với

có cấu hình tại C24,C25 là (24R, 25S) hoặc (24S,25R) được xác định là một sulfate

hexaol mới. Hợp chất 6-O-Sulfated heptaol (69) được phân lập từ loài sao biển

Hippasteria kurilensis [45].

Từ dịch chiết EtOH của loài sao biển Pteraster pulvillus thu thập ở vùng biển

Viễn Đông đã phân lập được 2 hợp chất disulfate steroid mới (70,71) [34] và hai

hợp chất muối sulfate steroid rất hiếm gặp là (20R)-5α-cholestane-3α,21-diol 3,21-

24R, 25S hoặc 24S, 25R 68