Nghiên Cứu Định Danh Loài Hoa Trứng Gà Yên Tử Magnolia Sp Bằng Chỉ Thị Hình Thái Và Adn Mã Vạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

NGUYỄN THỊ THỈNH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH LOÀI HOA TRỨNG GÀ YÊN TỬ

(MAGNOLIA SP.) BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ ADN MÃ VẠCH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. VŨ ĐÌNH DUY

2. PGS.TS. VŨ QUANG NAM

Hà Nội - 2021

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng

dẫn khoa học của TS. Vũ Đình Duy và PGS. TS. Vũ Quang Nam. Các số liệu,

kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất kì công trình nghiên cứu nào khác.

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nào đã

công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận

văn của Hội đồng khoa học.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Người thực hiện

Nguyễn Thị Thỉnh

ii

LỜI CẢM ƠN

Đề tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện

Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ sinh

học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn

chân thành tới ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện để các công việc chuyên

môn của đề tài được tiến hành thuận lợi.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Đình Duy và

PGS.TS. Vũ Quang Nam, hai người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá

trình hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn,

chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái Nhiệt

đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ sinh học Lâm

nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình

thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ của cơ sở đào tạo Sau đại học

trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt

khóa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô làm việc và giảng

dạy tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi

trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã

luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn.

Luận văn được hỗ trợ kinh phí bởi đề tài mã số GUST.STS.ĐT2019 –

ST01 và 106.03-2017.16.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Học viên

Nguyễn Thị Thỉnh

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..............................................................................................i

LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………………………ii

MỤC LỤC........................................................................................................iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT………………………………………………..……….vi

DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………………...……vii

DANH MỤC CÁC HÌNH………………………………………………………………...viii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................... 4

1.1. Đặc điểm về hình thái và vị trí phân loại của các loài thuộc chi Ngọc

lan (Magnolia L.) ........................................................................................... 4

1.1.1. Đặc điểm về hình thái các loài thuộc chi Ngọc lan (Magnolia L.) 4

1.1.2. Phân họ Ngọc lan (Magnolioideae) được phân loại theo hai tông 5

1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcodes)....................................... 6

1.2.1. Giới thiệu về mã vạch ADN ............................................................ 6

1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch ADN........................... 8

1.2.3. Một số vùng gen được sử dụng làm mã vạch ADN ở thực vật ....... 9

1.3. Ứng dụng mã vạch ADN trong nghiên cứu di truyền và tiến hóa các

loài trong chi Magnolia................................................................................ 12

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 15

2.1. Phương pháp khảo sát thực địa và thu thập mẫu vật ............................ 15

2.2. Địa điểm thực hiện nghiên cứu ............................................................. 16

2.3. Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu............................... 17

2.3.1. Hóa chất........................................................................................ 17

2.3.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu................................................ 17

2.4. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm................................ 17

2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................... 17

iv

2.4.2. Tách chiết ADN tổng số ................................................................ 18

2.4.3. Định lượng ADN tổng số .............................................................. 18

2.4.4. Trình tự mồi................................................................................... 19

2.4.5. Nhân dòng đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR.............................. 20

2.4.6. Phương pháp điện di ADN trên gel agrose 1,5%......................... 20

2.4.7. Giải trình tự nucleotide................................................................. 21

2.4.8. Hiệu chỉnh trình tự nucleotide ...................................................... 21

2.4.9. Phân tích mối quan hệ di truyền- xây dựng cây phát sinh chủng loại21

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 23

3.1. Nghiên cứu và phân tích giám định các đặc điểm hình thái và sinh học

của loài hoa Trứng gà yên tử........................................................................ 23

3.2. Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen lục lạp (matK) và gen nhân

(ITS-rDNA) của loài Hoa trứng gà yên tử.................................................... 28

3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số loài hoa Trứng gà yên tử .......... 28

3.2.2. Nhân bản trình tự ADN đích vùng gen matK và ITS- rDNA loài

Hoa trứng gà yên tử ................................................................................ 30

3.2.3. Xác định trình tự nucleotide và đăng ký Genbank vùng gen matK

và ITS- rDNA của loài Hoa trứng gà yên tử........................................... 31

3.2.4. Các đặc điểm ADN của loài Hoa trứng gà yên tử dựa trên trình tự

nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA ................................................ 33

3.3. Khả năng giám định của các vùng gen trong nghiên cứu đối với các loài

trong chi Magnolia....................................................................................... 34

3.3.1. Mức độ tương đồng và khoảng cách di truyền giữa loài nghiên

cứu với một số loài cùng chi Magnolia dựa trên trình tự nucleotide vùng

gen matK và ITS- rDNA.......................................................................... 34

3.3.2. Mối quan hệ di truyền giữa loài nghiên cứu với một số loài cùng

chi Magnolia dựa trên trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA.. 36

v

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 41

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN VĂN .................................................................................................... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 44

PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Giải nghĩa

1 ADN Deoxyribonucleic Acid

2 matK Gen maturase K

3 ITS-rDNA

Vùng đệm trong được sao mã (Internal

Transcribed Spacer)

4 Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế

5 ML Maximum Likelihood

6 NCBI National Center for Biotechnology Information

7 OD Mật độ quang học (Optical Density)

8 PCR Polymerase Chain Reaction

9 bp Cặp bazơ (base pair)

10 BLAST Basic Local Alignment Search Tool

11 rbcL Gen ribulose-bisphosphat carboxylase

12 CBOL Consortium for the Barcode of Life

13 ITSF Cặp mồi xuôi

14 ITSR Cặp mồi ngược

15 TAE Tris Acetate EDTA

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Bảng ký hiệu 19 mẫu Hoa trứng gà yên tử sử dụng trong nghiên cứu.16

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu...........................................19

Bảng 2.3. Danh sách các loài/thứ trong chi Magnolia trên GenBank sử dụng trong

nghiên cứu.....................................................................................................................19

Bảng 3.1. Một số đặc điểm so sánh giữa loài nghiên cứu với các loài gần nhất .23

Bảng 3.2. Độ sạch và hàm lượng ADN của 19 mẫu Hoa trứng gà yên tử .............29

Bảng 3.3. Thành phần base (%) trong vùng gen matK và ITS-rDNA của loài

nghiên cứu.....................................................................................................................34

Bảng 3.4. Thống kê đặc điểm ADN của loài Hoa trứng gà yên tử dựa trên trình tự

nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA...................................................................35

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật. (a) Vị trí

nhiễm sắc thể của các vùng rDNA. (b) Cấu tạo của vùng Intron, Exon liền kề

[62] .................................................................................................................. 10

Hình 1.2. Hệ gen lục lạp hoàn chỉnh của loài Magnolia zenii [54].................... 11

Hình 2.1. Hình ảnh Hoa và Quả của loài Hoa trứng gà yên tử (Magnolia sp.)

[Ảnh: Vũ Quang Nam].................................................................................... 16

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế trong nghiên cứu ...................................................... 18

Hình 2.3. Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm BioEdit..................... 21

Hình 3.1. Vỏ thân loài Hoa trứng gà yên tử.................................................... 25

Hình 3.2. Lá loài Hoa trứng gà yên tử ............................................................ 25

Hình 3.3. Nụ hoa loài Hoa trứng gà yên tử..................................................... 26

Hình 3.4. Hoa loài Hoa trứng gà yên tử.......................................................... 26

Hình 3.5. Quả và Hạt loài Hoa trứng gà yên tử .............................................. 26

Hình 3.6. Cành lá mang nhuỵ hoa và hoa loài Dạ hợp hồng kông (M.

championii)...................................................................................................... 27

Hình 3.7. Tiêu bản gốc của loài M. bawangensis........................................... 27

Hình 3.8. Tiêu bản gốc của loài M. shangsiensis............................................ 27

Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số 19 mẫu Hoa trứng gà yên tử trên gel

agarose 1% ...................................................................................................... 28

Hình 3.10. Sản phẩm PCR của một số mẫu Hoa trứng gà yên tử phân tích với

cặp mồi ITS- rDNA điện di trên gel agarose 1,5% (M: Marker phân tử 100bp;

1-19: ký hiệu mẫu) .......................................................................................... 30

Hình 3.11. Sản phẩm PCR của một số mẫu Hoa trứng gà yên tử phân tích với

cặp mồi matK điện di trên gel agarose 1,5% (M: Marker phân tử 100bp; 1-19:

ký hiệu mẫu).................................................................................................... 30

Hình 3.12. Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu với các loài trong cùng

chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-